分子动力学模拟与热稳定性实验相结合分析乙酰氨基葡萄糖与脂肪酶的相互作用机制

郑敦锦，沈锐锋，何康平，罗佳伟，陈胤熹，黄嘉惠，余洁婷，郑少鹏，古伟明,4，曹诗林*

（1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山 528225）（2.广东省食品智能制造重点实验室，佛山科学技术学院，广东佛山 528225）（3.华南农业大学食品学院，广东广州 510640）（4.广东工业大学轻工化工学院，广东广州 510006）

南极假丝酵母脂肪酶B（CaLB）是目前被重点研究的一类酯催化剂[1]。CaLB具有底物特异性、专一性，作用条件温和的通性，但与其它脂肪酶相比，CaLB具有更宽泛的温度及 pH值稳定性。CaLB可催化酯化、水解、聚合等反应[2]，因此被广泛应用于食品、生物医药[3]、纺织[4]等领域。但游离酶存在结构不稳定、易失活的缺点，限制了其在工业化上的推广应用。据报道，糖类物质在环境胁迫下（低温、干燥等）可对生物质材料起到保护性作用[5]。因此，可加入某些糖类物质作为保护剂提升游离CaLB的稳定性和储藏性能。目前，可作为酶保护剂的糖类包括海藻糖[6]、壳寡糖[7]、甲壳素[8]、羧甲基纤维素[9]、果糖[10]等，不同糖类对生物质材料的保护作用各有差异。

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine，GlcNAc）是许多重要多糖（几丁质和壳聚糖）的基本组成单位，主要存在于真菌、细菌以及动植物体内[11]，尤其是在甲壳类生物的外骨骼含量最高[12]。GlcNAc易溶于水，具有消炎[13]、抗肿瘤[14]以及抗氧化[15]等生物活性，且对维持生物体正常生理功能具有显著作用[16]。然而，目前尚未有报道研究乙酰氨基葡萄糖对游离CaLB的保护机制及相关实验。

分子动力学模拟能够从分子水平上[17]模拟蛋白的结构[18]以及与其他物质间的相互作用[19]。本文通过分子动力学模拟[20]与实验相结合的方法研究了南极假丝酵母脂肪酶 B（CaLB）与乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）装配体的构象，考察了CaLB与GlcNAc之间的作用机制对脂肪酶热稳定性的影响规律。CaLB与不同浓度GlcNAc混合生成CaLB-GlcNAc溶液混合物模型，分子动力学模拟后得到较理想的组装体模型，通过分析CaLB总体构象的变化，然后进行热稳定性实验，验证分子模拟的结果。本文所建立的分子模拟方法及实验验证方法，可以为研究其它酶与糖类物质的作用机制提供借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 研究材料

可表达南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母菌株：由本实验室自行构建并保藏。

本实验室保存的南极假丝酵母脂肪酶B（CaLB）表达质粒CaLB-HisTag-pPICZαA，该质粒表达的酶的序列为：EFLVPRGSLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTC QGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQ LGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYA GSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVD RLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTT GSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVS NSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTS QFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPAN DLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLM PYARPFAVGKRTCSGIVTPLVPRGSFLEQKLISEEDL HHHHHH。

乙酰氨基葡萄糖，购自湖北兴恒业科技有限公司；棕榈酸对硝基苯酯，购自上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、磷酸盐标准缓冲液（pH 7.5），购自源叶生物科技有限公司。

1.2 数据分析与作图相关软件

采用Modeller软件[21-22]对CaLB进行同源建模和模型优化，在线平台（https://mag.liulianpisa.top/login）与 UCLA-DOE的 SAVES服 务 器（https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）对模型进行质量评估。Packmol软件[23]生成不同浓度的 CaLBGlcNAc模型，Gromacs 2019.1软件[24]对模型进行分子动力学模拟，Pymol软件显示模型的三维结构。热稳定性实验的原始数据由酶标仪输出。

1.3 研究方法

1.3.1 CaLB同源建模与模型评估

首先，在 NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上获得南极假丝酵母脂肪酶 B（CaLB）（ID:1TCA）的氨基酸序列作为主要结构模板，然后应用BLAST工具对目标模板进行序列比对，当模板与目的蛋白的序列相似度大于 30%时，利用Modeller[21,22]进行同源建模和模型优化。

将优化后的模型放置于在线平台上获得拉氏图，再使用UCLA-DOE的SAVES服务器的Verify_3D模块进行评分，二者同时对同源建模的模型质量进行评价。

1.3.2 分子动力学模拟研究方法

分子动力学模拟使用Gromacs 2019.1软件[24]进行分析。分子动力学模拟分析的具体过程如下：首先，通过Packmol软件[23]将CaLB分别置于大小为11、10、9 nm的长方体模拟盒中心，然后将数量不同的GlcNAc及水分子填充到相应的模拟盒中，得到不同浓度（250、500、750、1000 mmol/L）的CaLB-GlcNAc模型。为保持盒子的总电荷数为 0，对各个模型进行电中性处理。采用Amber 03力场，先将体系进行能量最小化（EM）处理，然后进行100 ps的约束溶质分子平衡模拟（NVT、NPT）处理，游离 CaLB在303.15～323.15 K具有良好的热稳定性，故最后将各个模型在323.15 K下进行100 ns的无约束恒温分子MD模拟。待模型平衡后，输出模拟数据并进行分析。

1.3.3 热稳定性实验设计

将CaLB酶样品分别加入0、250、500、750、1000 mmol/L的乙酰氨基葡萄糖溶液，获得CaLB-GlcNAc混合溶液；然后，将游离CALB酶液及混合溶液分别置于60、70、80 ℃水浴锅中热处理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，随后测试酶活性。

酶活性测试方法[25]如下：200 μL缓冲液与25 μL酶液混合，加入25 μL底物溶液后，立即读取410 nm波长下0～5 min的吸光值，并以该过程变化曲线的斜率来表征相对酶活，重复实验三次，取平均值。

1.4 数据处理

1.4.1 南极假丝酵母脂肪酶B与乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）组装分析

势能分析：分析了 0～100 ns模拟中 CaLB与GlcNAc之间的静电和Lennard-Jones相互作用。氢键、溶剂可达面积（SASA）分析：对0～100 ns范围内的CaLB-溶剂和CaLB-GlcNAc进行氢键数和SASA分析，并计算了GlcNAc浓度从0增加至1000 mmol/L，酶与GlcNAc之间的氢键数变化情况和蛋白可及面积的变化情况。

1.4.2 南极假丝酵母脂肪酶B总体构象变化

均方根波动（RMSF）分析：为研究 GlcNAc对CaLB柔韧性的影响，对CaLB和CaLB-GlcNAc的每个残基对计算平均RMSF。均方根（Root-mean-square deviation，RMSD）分析：计算游离酶模型及CaLB-GlcNAc模型的RMSD，研究GlcNAc对脂肪酶的结构稳定性的影响。

1.4.3 不同温度下CALB与乙酰氨基葡萄糖的热稳定性

相对酶活力分析：将游离CaLB酶液（Free-CaLB）及GlcNAc-CaLB混合液置于60、70、80 ℃温度下，分别热处理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，之后以棕榈酸对硝基苯酯以底物测定二者的相对酶活力。

2 结果与讨论

2.1 模型评估结果

2.1.1 Ramanchandran Plot（拉氏图）评价

拉氏图是通过蛋白中非键合原子间最小接触距离来评价两个相邻肽单位骨架构象是否合理，并以此得出蛋白的允许和不允许区域，位于允许区域的氨基酸数应占总氨基酸数的95%以上[26]。图1中的蓝色区域为“最适区”，位于该区域的氨基酸数量越多，则模型的可信度越大；紫色区域为“允许区”；白色区域为“不允许区”，该区域的氨基酸是为构象不合理的氨基酸，需要进行优化，且该区域的氨基酸数应小于 5%，否则模型的可信度低。对图1进行数据输出可知：该模型的氨基酸总数为349个，其中位于不允许区域的氨基酸数为10个，占比约为2.87%＜5%，证明该模型的可信度较高。

2.1.2 Verify_3D评价

模型的三维结构（3D）与氨基酸一级序列（1D）的相容性可以通过Verify_3D可分析，进而分析模型侧链构象的合理性[27]。一般而言，超过80%氨基酸残基的平均3D-1D分数≥0.2的模型是可行的，图2表示CaLB蛋白模型中有80.22%氨基酸残基的3D-1D分数≥0.2，且大部分的残基 Verify_3D 评分＞0，表明该模型的侧链构象良好，可信度较高。

2.2 CaLB和GlcNAc自组装过程分析

2.2.1 L-J势能和静电势能分析

为了研究CaLB与GlcNAc在溶液中的相互作用，分析了323.15 K下CaLB与不同浓度GlcNAc（250、500、750、1000 mmol/L）的静电和Lennard-Jones势能（图 3）。结果显示，CaLB-GlcNAc的静电势能与L-J势能在前20 ns模拟时间中显著降低。此外，随着GlcNAc浓度的升高，静电势能与 L-J势能下降值增大。CaLB-250 mmol/L-GlcNAc（图3a）模型在0～100 ns模拟过程中，静电势能下降了3350 kJ/mol，L-J势能下降了2791 kJ/mol。1000 mmol/L（图3d）的模拟盒在 0～100 ns模拟过程中，静电势能下降了 4992 kJ/mol，L-J势能下降了4340 kJ/mol。结果表明，CaLB与GlcNAc存在静电作用和L-J作用，且库仑作用略高于L-J作用。

2.2.2 氢键分析

各模型的模拟时间为0 ns时，蛋白与溶剂的氢键数（HBN）约为500，蛋白与GlcNAc的HBN约为0。比较各模型平衡后的氢键数据可知：当GlcNAc浓度增加500 mmol/L时，蛋白与GlcNAc之间的氢键数逐步增加到115，GlcNAc浓度从500 mmol/L增加至1000 mmol/L时，二者之间的 HBN变化不显著。表明250～500 mmol/L浓度的GlcNAc足以覆盖蛋白的表面并与其形成氢键作用。此外，观察图 4可知，随着GlcNAc浓度的增加，蛋白与溶剂间的HBN从500下降至300左右，而GlcNAc与CaLB之间的HBN则从0上升至150左右，表明GlcNAc与CaLB之间形成的氢键能取代部分CaLB与溶剂间的氢键。

2.2.3 CaLB和GlcNAc溶剂可及面积（SASA）分析

分析蛋白溶剂可及面积（SASA）的数据，如图5。比较各模型的平衡之后的蛋白SASA数据可知：模拟时间为20 ns时，GlcNAc浓度从0增至500 mmol/L，蛋白的SASA从160下降至50 nm2，当GlcNAc浓度增至750 mmol/L与1000 mmol/L，蛋白的SASA在30～40 nm2。因此，蛋白SASA的数据表明，在GlcNAc浓度在500 mmol/L时，GlcNAc已经充分占据了酶分子的表面,与氢键数量分析的结果相一致。

2.3 CaLB与GlcNAc组装体的整体构象

2.3.1 均方根偏差（RMSD）分析

分析模型的均方根偏差（RMSD）可以揭示GlcNAc对脂肪酶结构稳定性的影响。如图6所示，在323.15 K下，游离酶模型（Free-CaLB）平衡后的RMSD约为 0.2617 nm，其余四个不同浓度的CaLB-GlcNAc模型的RMSD数值均小于Free-CaLB模型的RMSD数值。

表1 Free-CaLB-SOL与不同浓度GlcNAc最后10 ns的RMSD平均值数据分析表（353.15 K）Table 1 The last 10 ns RMSD average data analysis table of Free-CaLB-SOL and different concentrations of GlcNAc(353.15 K)

在323.15 K的基础上，对Free-CaLB与250、500、750、1000 mmol/L的CaLB-GlcNAc模型进行了升温至353.15 K的处理，分析模型最后10 ns的RMSD来表征升温后GlcNAc对脂肪酶的结构稳定性的影响及探究CaLB的热稳定性。结果如表1所示，在353.15 K温度下，CaLB-GlcNAc模型的 RMSD数值均小于Free-CaLB的RMSD数值（0.3473 nm），揭示GlcNAc在353.15 K的条件下，仍可有效维持酶的原始结构，并提高其结构稳定性。

2.3.2 均方根波动（RMSF）分析

为了研究GlcNAc对CaLB结构柔性的影响，图7对比分析了Free-CaLB与不同浓度的CaLB-GlcNAc均方根波动（RMSF）数据。结果表明，各残基的RMSF在Free-CaLB和CaLB-GlcNAc组装体中表现出相同的趋势。进一步分析323.15 K时模拟盒的RMSF数据，结果发现在Free-CaLB模型中（Val 147-Leu 155）区域的波动较大，而CaLB-GlcNAc组装体模型在该区域的波动却有所减弱，表明（Val 147-Leu 155）区域在CaLB-GlcNAc组装体中的结构柔性较Free-CaLB弱。

2.3.3 不同温度下CALB与GlcNAc的热稳定性分析

为了验证 CaLB-GlcNAc模型的模拟效果，进行了CaLB与不同浓度GlcNAc的热稳定性实验。实验结果如图8所示，CaLB-GlcNAc热稳定性要优于游离酶，并且随着GlcNAc浓度增加，CaLB在不同温度热处理时的酶活保留率相对增加。此外，由图8a所示，游离CaLB在60 ℃热处理0.5 h后，其相对酶活力仅剩37.21%，而与浓度为750～1000 mmol/L的GlcNAc共同作用的CaLB，其相对酶活力保留＞90%；在该温度下热处理2.0 h后，游离CaLB的相对酶活力仅剩22.26%，而750～1000 mmol/L GlcNAc溶液中的CaLB活性依旧保持有 52.11%。可见，在溶液中，加入GlcNAc可有效提高CaLB的热稳定性，这与分子模拟的结果具有一定的吻合之处。

2.3.4 讨论

乙酰氨基葡萄糖是一种功能性糖，但目前关于乙酰氨基葡萄糖与脂肪酶相互作用的分子动力学模拟及热稳定性实验研究鲜有报道。N-乙酰氨基葡萄糖经β-1,4-糖苷键连接形成甲壳素，甲壳素脱去乙酰基及降解后形成壳寡糖（OCTS），因此，乙酰氨基葡萄糖与壳寡糖都属于甲壳素衍生物的范畴。杨宝燕[28]使用分子动力学模拟方法研究了壳寡糖与南极假丝酵母脂肪酶B的相互作用机制，模拟结果显示：CaLB与OCTS之间存在静电相互作用和氢键相互作用，并且 CaLB与OCTS之间的氢键数量增加，CaLB与OCTS之间的SASA明显降低，使得脂肪酶被壳寡糖包裹住，从而使脂肪酶的蛋白结构变稳定，但壳寡糖在实验中是否能够提高脂肪酶的热稳定性仍需进一步研究。

相比之下，本文不但从分子动力学模拟的角度分析了GlcNAc与CaLB之间的氢键数、SASA的变化情况等来研究脂肪酶与乙酰氨基葡萄糖之间的相互作用机制，进一步通过热稳定性实验进行论证，结果显示：乙酰氨基葡萄糖可以提高南极假丝酵母脂肪酶B的热稳定性，这与分子动力学模拟结论具有一定的吻合性。

3 结论

本实验利用分子动力学模拟及实验论证方法研究了南极假丝酵母脂肪酶B与乙酰氨基葡萄糖的相互作用及酶的热稳定性实验。分子动力学模拟势能与氢键分析表明：CaLB与GlcNAc之间的组装过程存在静电作用和L-J作用，并且随着GlcNAc浓度的增加，蛋白与GlcNAc之间的HBN增加（由0增至115），取代了CaLB与溶剂间的部分氢键。此外，当 GlcNAc的浓度为250～500 mmol/L时，GlcNAc足以覆盖蛋白的表面与其形成氢键作用。RMSD、RMSF和 SASA数据表明：不同浓度的 CaLB-GlcNAc模型波动程度明显小于Free-CaLB模型，且当GlcNAc浓度为500 mmol/L时，酶分子的表面已被GlcNAc充分覆盖（此时的SASA由160下降到40 nm2），这表明GlcNAc可有效维持脂肪酶的原始结构。CaLB与GlcNAc的热稳定性实验也表明了GlcNAc可以有效维持CaLB的天然结构并提高其结构的稳定性。