miR-let-7b-5p对急性胰腺炎AR42J细胞凋亡及自噬的作用研究*

(右江民族医学院附属医院消化内科，广西 百色 533000)

急性胰腺炎是消化系统常见疾病之一，一旦发展为重症，病死率高。有研究表明，在急性胰腺炎的病情发展过程中，凋亡和自噬起着重要的作用[1]。miRNA是一种短链非编码RNA，能通过抑制转录或者降解mRNA进行转录后调控，在凋亡和自噬的信号通路调节过程中发挥着重要作用。研究发现miR-494抑制急性胰腺炎时促凋亡蛋白ROCK1和PTEN的表达，进而抑制胰腺腺泡细胞凋亡，促进急性胰腺炎的发展[2]。miR-155通过靶向Rictor加重雨蛙素诱导的急性胰腺炎AR42J细胞自噬受损[3]。miR-let-7家族是miRNA的一员，可通过直接或间接的方式有效抑制蛋白质的翻译，调节细胞周期和生长，在多种疾病中起着调控作用。有研究发现miR-let-7家族成员与胰腺疾病有关[4]，同时，miR-let-7家族也与凋亡、自噬密切相关[5-7]，miR-let-7b-5p作为miR-let-7家族的重要亚型之一，在多种疾病中被发现可通过调节凋亡和自噬水平影响疾病进展[8-9]，但是能否通过调控凋亡和自噬来影响急性胰腺炎的发病，目前尚未见报道。本文研究miR-let-7b-5p对急性胰腺炎AR42J凋亡和自噬的作用，以期为急性胰腺炎的发病机制以及临床诊疗提供理论依据和研究思路。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株 大鼠胰腺外分泌细胞AR42J、Ham’s F-12K培养基 、多聚赖氨酸均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胎牛血清购自Gibco公司；青-链霉素、胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2其他相关试剂和仪器 雨蛙素购自上海源叶生物科技有限公司；慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司；TRIZOL 试剂购自赛默飞世尔科技公司，RT-qPCR引物、miRNA 第一链cDNA试剂盒购自上海生工；SYBR Green扩增试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；mRNA第一链cDNA试剂盒、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、SDS-PAGE快速凝胶配制试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、20×TBST、封闭液购自上海碧云天生物技术有限公司；彩虹Marker、Caspase-3抗体购自英国Abcam；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(4×)、超敏ECL化学发光试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；LC3抗体购自Proteintech；GAPDH抗体、兔抗鼠IgG HRP购自Affinity；PVDF膜购自美国 Millpore公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和实验分组 将处于对数生长期的AR42J以1×105个/毫升浓度种板，含20%胎牛血清+1%青链霉素+Ham’s F-12K培养基，于5%二氧化碳、37 ℃培养箱中进行培养。2～3 d换1次液，1周时以1∶2～1∶4的比例传代。传代后24 h贴壁，贴壁困难时，可采用0.1 mg/ml的多聚赖氨酸提前包被培养瓶。包被好的培养瓶，封口膜封口后存于4 ℃冰箱，1周内用完。实验共分为4组，正常对照组：AR42J细胞常规培养；阴性对照组：在完全培养基中添加含1×10-8mol/L的雨蛙素培养细胞24 h后，转染空载体慢病毒；miR-let-7b-5p过表达组：含1×10-8mol/L雨蛙素的完全培养基培养24 h后，按照MOI=15，在培养基中添加LV-rno-MiR-let-7b-5p-mimic及HiTransG P病毒感染试剂，共培养16 h后更换新的完全培养基；miR-let-7b-5p低表达组：含1×10-8mol/L雨蛙素的完全培养基，按照MOI=10，在培养基中添加LV-rno-MiR-let-7b-5p-inhibition及HiTransG P病毒感染试剂，共培养16 h后更换新的完全培养基。

1.2.2慢病毒载体转染及稳定转染株的筛选 常规培养的细胞以1×105个/毫升的密度种板，慢病毒转染24～72 h后倒置荧光显微镜下观察转染效率，选取感染效率为80%左右的病毒浓度作为慢病毒的最终感染浓度。常规培养的细胞稀释到1000个/毫升种板，100～1000 μg/ml浓度范围内设置浓度梯度，选择在10～14 d内杀死全部细胞的新霉素浓度作为稳转株的最适筛选浓度，维持浓度减半。

1.2.3RT-qPCR实验 TRIZOL法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定所提取RNA的纯度及浓度，试剂盒逆转录成cDNA，以U6作为miR-let-7b-5p的内参，GAPDH作为Caspase-3和LC3 Ⅱ的内参，SYBR Green 、两步法检测扩增效率，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，实验重复3次。见表1。

表1 RT-qPCR实验各基因引物序列

1.2.4Western Blot实验 采用添加了1%蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液(强)提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定各组样品蛋白的浓度，以20 μg蛋白浓度进行SDS-PAGE凝胶电泳，常规湿法转膜后，5%牛血清白蛋白封闭2 h，分别用1∶16 500的鼠抗兔单克隆抗体GAPDH、1∶1 000鼠抗兔的单克隆抗体Caspase-3和1∶3 000的鼠抗兔多克隆抗体LC3 Ⅱ 的一抗4 ℃摇床孵育过夜，IgG-HRP标记的鼠抗兔二抗4 ℃摇床孵育2 h，增强化学发光( ECL) 显影。利用 Image J软件进行灰度值分析，用Caspase-3和LC3 Ⅱ蛋白条带与GAPDH灰度值的比值计算各自的相对表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，GraphPad prism 9.0做图。所有数据均进行正态分布和方差齐性检验。两组间的比较采用两独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析。P<0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1成功培养AR42J细胞 AR42J细胞在适宜的培养条件下，细胞贴壁生长，状态良好。细胞生长缓慢，呈中空球形集落，上皮细胞样，团簇状生长。给药24 h后，细胞胞质内出现大量空泡。

2.2慢病毒转染成功 转染成功的细胞在荧光显微镜下可观察到明亮红色荧光，未转染的细胞没有荧光，转染效率>80%可用于后续实验，如图1A所示。最终筛选出过表达慢病毒MOI=15，低表达慢病毒MOI=10，阴性对照组慢病毒MOI=10，最适遗传新筛选浓度为400 μg/ml，维持浓度为200 μg/ml。为进一步验证miR-let-7b-5p过表达/低表达慢病毒的转染效果，我们用RT-qPCR实验检测了转染两种慢病毒前后miR-let-7b-5p 的相对表达量，发现相比于阴性对照组，过表达组miR-let-7b-5p表达水平显著增高(P<0.01)，而低表达组miR-let-7b-5p表达水平显著降低(P<0.01)，如图1B所示。

A：急性胰腺炎AR42J细胞；B：RT-qPCR验证慢病

2.3RT-qPCR检测miR-let-7b-5p和Caspase-3、LC3 Ⅱ 的相对表达量 相比于正常对照组，阴性对照组的miR-let-7b-5p表达量显著降低(P<0.01)，Caspase-3 mRNA水平显著升高(P<0.01)，LC3 Ⅱ mRNA水平显著升高(P<0.01)，如图2A所示。相比于阴性对照组，miR-let-7b-5p过表达组Caspase-3 mRNA水平降低(P<0.05)，LC3 Ⅱ mRNA水平显著降低(P<0.01)；而miR-let-7b-5p低表达组Caspase-3 mRNA(P<0.01)水平显著升高，LC3 Ⅱ mRNA水平显著升高(P<0.01)，如图2B所示。

2.4Western blot检测Caspase-3和LC3 Ⅱ蛋白表达量 与正常对照组相比，阴性对照组的Caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.01)，LC3 Ⅱ蛋白表达量升高(P<0.05)，如图3A所示。与阴性对照组相比，miR-let-7b-5p过表达组Caspase-3蛋白表达量显著降低(P<0.01)，LC3 Ⅱ蛋白表达量降低(P<0.05)；而miR-let-7b-5p低表达组Caspase-3蛋白表达量增高(P<0.05)，LC3 Ⅱ蛋白表达量增高(P<0.05)，如图3B所示。

A：与正常对照组相比，*为P<0.01；B：与阴性

A：与正常对照组相比，*为P<0.01，#为P<0.05；

3 讨论

急性胰腺炎是一种临床常见的疾病，目前公认的发病机制为胰腺分泌的胰蛋白酶原被过早激活，导致胰腺本身的自我消化，但是这一机制发生的具体调节过程目前尚不清楚。多项研究证实急性胰腺炎的发病与凋亡和自噬水平的升高密切相关[10-11]。在正常的胰腺中存在一定量的基础凋亡和基础自噬，有利于维护胰腺的健康状态[12]，但是在某些致病因素的刺激下，凋亡和自噬发生异常，可导致这一过程出现紊乱，引发疾病。自噬与凋亡往往在急性胰腺炎中共同参与对胰腺细胞的调控，腺泡细胞凋亡常常被认为是一种保护机制，而自噬则参与了胰蛋白酶原的激活[13]。抑制胰腺腺泡细胞的凋亡可加重急性胰腺炎的炎症反应，诱导凋亡可使炎症反应减轻，即细胞凋亡在急性胰腺炎的发病过程中起着保护作用[14]。有研究发现在急性胰腺炎早期，胰腺腺泡细胞内自噬小体数量明显增多，并且这种变化与胰酶原的异常激活密切相关，胰腺腺泡细胞内的自噬损伤可引发多种胰腺疾病，包括急性胰腺炎、慢性胰腺炎[15]，甚至是胰腺癌[16-17]。MiR-let-7b-5p作为miR-let-7家族的重要成员，在胰腺疾病中也有异常表达：miR-let-7家族存在于正常胰腺细胞内，但在分化差的胰腺导管腺癌样本中丢失[18]。

大鼠胰腺外分泌细胞株AR42J具有与胰腺外分泌细胞极其相似的生物学特性，这使得体外AR42J细胞的实验研究结果能够在很大程度上代表体内实验，雨蛙素诱导的急性胰腺炎主要引起胰腺腺泡细胞的损伤。Caspase-3是凋亡执行的关键蛋白之一，Caspase-3蛋白含量的改变，可反映出早期的细胞凋亡水平的变化。诱导急性胰腺炎大鼠腺泡细胞凋亡数量增加后，Caspase-3 活性明显增加，急性胰腺炎的病理损伤和炎症反应减轻[19]。槲皮素3-O-芸香糖苷可以引起凋亡蛋白Caspase-3的表达增加，促进胰腺细胞的凋亡，减轻急性胰腺炎[20]。三七总皂苷可通过增加Caspase-3的表达减轻牛黄胆酸钠诱导的重症急性胰腺炎病情[21]。LC3 Ⅱ的含量与自噬成正相关，LC3 Ⅱ蛋白的相对表达量，通常可以用来反映自噬的活性变化。研究发现LC3 Ⅱ在急性胰腺炎组织中，随着炎症的加重与炎症反应时间的推移，表达持续增高[22]。抑制急性胰腺炎AR42J细胞的AMPK磷酸化水平，可导致自噬通量受损，细胞内自噬空泡的数量明显增多[23]。本研究发现雨蛙素诱导的急性胰腺炎AR42J细胞Caspase-3、LC3 Ⅱ mRNA和蛋白水平升高，与前人研究一致。

目前急性胰腺炎腺泡细胞凋亡、自噬的调控机制尚不清楚，研究发现miR-let-7家族与凋亡、自噬和疾病进展有关[8-9]，但是是否与急性胰腺炎细胞凋亡和自噬相关尚不明确。我们通过建立雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型，发现急性胰腺炎细胞miR-let-7b-5p水平与正常对照组相比明显降低。利用慢病毒转染的方式上调急性胰腺炎细胞模型的miR-let-7b-5p的表达水平后，凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ表达降低，而下调miR-let-7b-5p的表达水平后，凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ表达升高，提示miR-let-7b-5p可能通过调控凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ的水平来进一步调控急性胰腺炎的凋亡和自噬。

综上所述，miR-let-7b-5p可通过调控凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ的水平来进一步调控急性胰腺炎的凋亡和自噬水平，miR-let-7b-5p或许能成为急性胰腺炎的新的诊断标志物或者治疗靶点。