灵芝多糖羧甲基化修饰及抗氧化性研究

张银英,朱静祎,潘裕添,2,林志超,2,吴启赐,3*

（1.闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建 漳州 363000；2.福建省菌类活性物质工程技术研究中心,福建 漳州 363000；3.福建伯利赛克莱生物科技有限公司,福建 漳州 363000）

灵芝（Ganoderma lucidum）是世界名贵的食药两用菌，具有很高的营养价值和药用价值[1].据《神农本草经》记载“灵芝不燥不寒无毒，益心气，助心充脉，补中，好颜色，增智慧，利关节，久食轻身不老，延年神仙”[2].灵芝多糖（Ganoderma lucidumpolysaccharide，GLP）存在于灵芝的菌丝体和子实体中，是灵芝的主要活性成分，目前已分离出200 多种灵芝多糖[3].构成灵芝多糖的结构单体除葡萄糖外，大多还有阿拉伯糖、木糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖等单糖，单体间通过不同比例和类型的糖苷键连接而成，结构复杂，因而具有丰富的生物学活性.据报道，灵芝多糖有免疫调节[4]、抗肿瘤[5]、降血糖及抗糖尿病及其并发症[6-9]、抗炎[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]，促进肠上皮细胞修复[13]等功能，在国内外被广泛关注和应用.

研究表明具有多种生物活性的多糖绝大多数是水溶性的，多糖结构会直接或间接地影响其活性[14].通过化学改性，如羧甲基化、乙酰化、硫酸化、磷酸化等修饰手段，使多糖发生衍生化或转化.一方面，可以改善水溶性，提高生物活性，甚至可以开拓新的生物学功能；另一方面，提高多糖水溶性还可以减少因多糖溶解所导致的时间和能量消耗，提高效率.因此，水不溶性多糖的改性研究对于改变多糖的性质和生物活性具有重要意义.

羧甲基化是指向多糖中引入羧甲基官能团，进而提高多糖的水溶性和生物活性[15-19].本文采用碱溶性GLP 为原料，通过羧甲基化修饰，得到水溶性的羧甲基化灵芝多糖CM-GLP，并对不同取代度（degree of substitution，DS）的CM-GLP 进行了溶解性和红外光谱分析，探索其体外抗氧化活性，研究结果可为碱溶性多糖的拓展应用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GLP，福建省菌类活性物质工程技术研究中心；氯乙酸，上海麦克林生化科技有限公司；透析袋MD77（3.5 kDμ），美国Viskase.其余试剂均为市售分析纯，现配现用.

1.2 仪器设备

恒温水浴锅（RE-2002），巩义市予华仪器有限责任公司；旋转蒸发设备（EV 322），北京莱伯泰科仪器股份有限公司；电子天平（TX323L），梅特勒-托利多仪器有限公司；pH 计（TX323L），梅特勒-托利多仪器有限公司；数显恒温磁力搅拌器（85-2A），金坛市江南仪器厂；紫外可见分光光度计（UV-3200PC），上海美谱达仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（101 型），永光明医疗仪器有限公司；高速冷冻离心机（Centrifuge 5810 R），德国Eppendorf 公司；真空冷冻干燥机（LG-0.2），新阳速冻设备制造有限公司；红外光谱扫描仪（NICOLET IS10），美国Nicolet公司.

1.3 实验方法

1.3.1 羧甲基灵芝多糖的制备及其制备工艺优化

按照芦昶通等人的方法[20]适当修改.1 g灵芝多糖溶解在120 mL的NaOH 溶液中，室温下碱化1 h.碱化结束后，将氯乙酸溶解于80 mL异丙醇中，然后边搅拌边缓慢滴加至上述反应液中，放入水浴锅醚化2 h.反应结束后，室温萃取，弃除上层醇液，收集下层水相，加入4 倍体积95%乙醇进行沉淀，静置12 h.离心，沉淀用少量纯水溶解，再用10%盐酸溶液调节pH 至中性，再次加入4 倍体积的95%乙醇，沉淀8 h，抽滤，95%乙醇洗涤沉淀两次.将沉淀溶于少量纯水，4 ℃纯水透析48 h，经冻干得羧甲基灵芝多糖CM-GLP.

（1）单因素实验

（a）氯乙酸用量

固定醚化时间2 h、醚化温度60 ℃、NaOH 浓度为4.5 mol/L，考察氯乙酸用量（分别为2.6、3、3.4、3.8、4.2、4.6 g）对CM-GLP取代度的影响.

（b）醚化温度

固定醚化时间2 h、氯乙酸用量为3.4 g、NaOH浓度为4.5 mol/L，考察醚化温度分别为（30、40、50、60、70、80 ℃）对CM-GLP取代度的影响.

（c）NaOH浓度

固定醚化时间2 h、氯乙酸用量为3.4 g、醚化温度为60 ℃，考察NaOH 浓度（分别为3.5、4、4.5、5、5.5、6 mol/L）对CM-GLP取代度的影响.

（2）正交试验

以CM-GLP 的取代度为指标，根据单因素实验的结果，选取对取代度影响较大的三个因素即氯乙酸用量（A），NaOH 溶液浓度（B），醚化温度（C）和其中三个最优水平进行正交优化试验，进而确定灵芝多糖羧甲基化的最佳工艺参数.其优化试验设计见表1.

表1 CM-GLP羧甲基化工艺优化的因素水平表Tab.1 Orthogonal factors and levels table of carboxymethylation process of CM-GLP

1.3.2 CM-GLP取代度

按照芦昶通等[20]的方法，取0.05 g CM-GLP 溶解在20 mL 标准HCl 溶液（0.1 mol/L）中，配制标准NaOH溶液（0.1 mol/L）并用其来滴定溶解好的溶液，记录V1，V2.DS计算如下：

其中，V1：滴定过程中pH=2.1 时使用NaOH 溶液体积；V2：滴定过程中pH=4.3 时使用NaOH 溶液体积；m：CM-GLP质量/g；C：NaOH溶液浓度/（mol/L）.

1.3.3 溶解性测定

根据2020 版《中国药典》凡例项下溶解度测定方法，稍作修改，分别称取100 mg GLP 和不同取代度CM-GLP加入含有10 mL纯水的试管中，室温下充分振摇再静置30 min，观察样品在纯水中的溶解情况.

1.3.4 红外光谱分析

采用KBr压片法进行红外光谱分析[21].CM-GLP和GLP样品与KBr粉末经红外干燥4 h，将1 mg样品均匀混合至100 mg KBr 中，充分研磨后压片，上机扫描，光谱范围：4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描16次.

1.3.5 体外抗氧化性分析

（1）溶液配制

分别称取100 mg 不同取代度的CM-GLP，溶于10 mL 纯水中，配制成浓度为10 mg/mL 的母液，经稀释得质量浓度为0.1、0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL的样品溶液.

（2）羟基自由基（•OH）清除能力

羟基自由基清除能力测定根据文献方法略作修改[22].取6根试管，分别依次加入2 mL CM-GLP溶液、2 mL 2 mmoL/L 的FeSO4溶液、2 mL 2 mmoL/L 的水杨酸溶液和1 mL 2 mmoL/L 的H2O2溶液，充分振荡均匀后，室温下避光静置30 min，分光光度计测定（波长为510 nm）其吸光度值（A1）.空白组用蒸馏水替代样品溶液，吸光度值（A0）；对照组用蒸馏水替代H2O2，吸光度值（A2）.以维生素C（VC）为阳性对照，按照CMGLP浓度梯度绘制变化曲线.

•OH清除率公式如式（3）所示：

其中，A0：空白组；A1：样品组；A2：对照组.

（3）总还原力

总还原力测定根据文献方法略作修改[23].将1 mL样品添加到干燥试管中，加入2.5 mL磷酸缓冲液和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液.将反应液充分振荡混合，50°C 水浴加热20 min，然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混合均匀，室温下离心（8 000 rpm，10 min）.取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液，充分振荡混匀，避光静置10 min，分光光度计测定（波长为700 nm）样品溶液吸光度值（A1），空白组用蒸馏水替代样品溶液，其余处理同上，测定吸光度（A0）.以VC为阳性对照，按照CM-GLP 浓度梯度绘制变化曲线.

总还原力公式（4）为：

其中，A0：空白组；A1：样品组.

1.3.6 数据处理方法

所有实验都至少3次处理，所有数据结果用均值±标准差表示.采用SPSS Statistics 26.0软件对实验结果进行单因素显著性分析，P<0.05表示结果显著，并用不同字母标示.

2 结果与分析

2.1 羧甲基灵芝多糖的制备

2.1.1 单因素实验

（1）氯乙酸用量的影响

考察氯乙酸用量对CM-GLP 取代度的影响，结果如图1所示，随氯乙酸用量的增加，羧甲基取代度呈先增加后减小的趋势.当氯乙酸用量为3.4 g 时，CM-GLP 取代度到达最高值为4.72.在NaOH 碱化GLP过程中，由于加入的碱量一定，因此形成的多糖钠盐活性中心一定[24]，当氯乙酸用量增加时，氯乙酸与GLP的活性中心相互碰撞的机率也会增加，所以CM-GLP的取代度增大；然而氯乙酸用量太高时，多余的氯乙酸会与碱反应，从而改变整个碱性环境体系，碱性变弱，可能导致两种趋势：一方面，醚化反应速率逐渐降低，副反应逐渐增加，因此羧甲基取代度降低，另一方面，碱溶性多糖溶解度下降，也可能导致反应速率下降，所以选取3.4 g作为最佳氯乙酸用量.

图1 氯乙酸用量对GLP取代度的影响Fig.1 Effect of chloroacetic acid dosage on the degree of substitution of CM-GLP

（2）NaOH浓度对CM-GLP取代度的影响

NaOH 浓度与取代度呈钟形曲线关系（图2），随着NaOH 浓度的增大，CM-GLP 取代度呈现先增后降的趋势，当NaOH 溶液浓度为4.5 mol/L 时，CM-GLP 取代度达到最大为4.10.在碱化反应中，NaOH 溶液提供了碱性的反应环境，而且NaOH 溶液可以中和反应过程中释放出来的酸类物质，促进多糖溶胀[25]，从而可以提高醚化反应活力，使得取代度上升.当NaOH 溶液浓度过高时，灵芝多糖在强碱浓度下会发生降解，且降解比较严重[26]；另外，过高的NaOH浓度将影响氯乙酸浓度在体系内的浓度，进而导致CM-GLP取代度下降，因此选取4.5 mol/L作为最佳NaOH浓度.

图2 NaOH浓度对CM-GLP取代度的影响Fig.2 Effect of NaOH concentration on the degree of substitution of CM-GLP

（3）醚化温度对CM-GLP取代度的影响

醚化温度对CM-GLP取代度的影响结果如图3所示，随醚化温度的升高，羧甲基取代度呈先增加后减小的趋势.当醚化温度为60°C时，CM-GLP取代度达到最大为4.87.温度升高会加快反应速率，因此能促进醚化反应发生，取代度逐渐提高，然而随着温度进一步升高，副反应速率也会随之增加，并且在高温下多糖通常会被降解[27]，导致已被取代的羧甲基再次被裂解[25]，也可能是因为不利于灵芝多糖羟基基团的显露，而且逐渐缩小反应空间，不利于取代反应[19]，从而使羧甲基取代度逐渐降低.因此，选取60 ℃作为最佳醚化温度.

图3 醚化温度对CM-GLP取代度的影响Fig.3 Effect of etherification temperature on the degree of substitution CM-GLP

2.1.2 CM-GLP羧甲基化工艺正交试验优化结果

CM-GLP 羧甲基化工艺正交试验优化结果见表2，根据R值大小可知，灵芝多糖羧甲基化结构修饰的影响因素的主次顺序为B>C>A，即NaOH 浓度>醚化温度>氯乙酸用量，理论最优工艺组合为A3B2C3，即氯乙酸添加量为4.0 g，NaOH 浓度为4.5 mol/L，醚化温度为65 ℃，理论上此条件下取代效果最好.进一步对该工艺参数进行方差分析，结果发现（表3），因素B 和C 对试验结果有显著影响，其中因素B 对CMGLP取代度的影响极显著，而因素A各水平改变对CM-GLP取代度影响不显著.

表2 CM-GLP羧甲基化工艺正交试验优化结果Tab.2 Optimization of carboxymethylation process of CM-GLP by orthogonal test

表3 CM-GLP羧甲基化工艺优化结果的方差分析Tab.3 Variance analysis of carboxymethylation process of CM-GLP

然而，正交试验结果中最高取代度（4.83）却出现在工艺组合A2B2C3 中，即氯乙酸添加量为3.8 g，NaOH浓度为4.5 mol/L，醚化温度为65 ℃.因此，需对理论最优工艺进行验证，结果如表4所示，理论最优工艺的取代度为4.94，与正交试验的最优工艺结果相比，没有显著提高（仅提高2.49%）.因此，选择组合A2B2C3为最优工艺，不仅能节约氯乙酸用量，还能减少因过度使用氯乙酸而引起的一系列环境问题.

表4 工艺验证Tab.4 Process verification

2.2 溶解性

采用药典方法分析CM-GLP 的溶解性.选取取代度为4.58、3.54 和1.86 的CM-GLP，分别标记为CM-GLP-H、CM-GLP-M 和CM-GLP-L.结果显示，在该测试条件下，CM-GLP-H 的溶解度≥10 mg/mL；CM-GLP-M 和CM-GLP-L 在相同溶解条件下，均有不同程度的剩余量，并且CM-GLP-M 比CM-GLP-L 的不溶物更少；而GLP则大部分没有溶解.可见GLP经羧甲基化后，溶解性明显提高，并且溶解性与羧甲基的取代度呈正相关.

2.3 红外光谱分析

GLP 和不同取代度CM-GLP 的红外光谱如图4所示.GLP 和CM-GLP 在4 000～500 cm-1范围内图谱基本相似，只存在部分差异.GLP 和CM-GLP 在1 000～1 100 cm-1、1 400～1 530 cm-1、2 800～2 900 cm-1和3 100～3 500 cm-1均有多糖的特征吸收峰.3 400 cm-1附近是羟基（O-H）的伸缩振动峰，经羧甲基化后，吸收峰由3 408 cm-1高波数移动（3 423.8 cm-1）.2 920 cm-1附近是烷基的（C-H）的伸缩振动.CM-GLP在1 604 cm-1和1 324 cm-1附近发现吸收峰，说明存在羧基（C=O）的非对称和对称的伸缩振动[28]，意味着GLP 确实发生了醚化，表明（COO-）基团成功被连接到GLP上.

图4 GLP和CM-GLP的红外光谱分析Fig.4 Infrared spectrum analysis of GLP and CM-GLP

2.4 体外抗氧化性分析

考察CM-GLP的抗氧化性.如图5A（A：清除•OH 自由基活性）所示，CM-GLP是具有很强的清除羟基自由基能力，其清除能力与CM-GLP 浓度和取代度呈正相关.在0.5～10 mg/mL 浓度范围内，CM-GLP 清除自由基能力约为10%～98%.当浓度为10 mg/mL 时，CM-GLP-H 清除能力最强为97.99%，CM-GLP-M稍差（97.21%），CM-GLP-L最弱（94.60%）.

由图5B（B：还原力）可知CM-GLP 具有一定的还原力，其变化规律与清除羟基自由基能力基本一致.随着CM-GLP 浓度和取代度的增加，CM-GLP 还原力也随之加强，说明还原力与CM-GLP 浓度和取代度呈正相关.在0.5～10 mg/mL 浓度范围内，CM-GLP 还原力为0.007～0.214.当浓度为10 mg/mL 时，CMGLP-H还原力最强，为0.214.

图5 CM-GLP的体外抗氧化性分析Fig.5 In vitro antioxidant analysis of CM-GLP

3 结论

本文以碱溶性灵芝多糖为原料，通过羧甲基化改性制备了羧甲基灵芝多糖CM-GLP，利用正交试验优化了灵芝多糖羧甲基化工艺，并对CM-GLP进行了水溶性和红外光谱分析，研究其体外抗氧化活性，得到如下结论：

（1）通过单因素实验可知，氯乙酸用量、NaOH浓度、醚化温度等因素与CM-GLP取代度之间的关系呈钟形曲线变化.在单因素的基础上采用正交试验设计探究CM-GLP 的最佳工艺为氯乙酸用量3.8 g，NaOH浓度4.5 mol/L，醚化温度65 ℃；进行验证实验，得到CM-GLP的平均取代度为4.82，优化工艺准确可靠.

（2）对不同取代度CM-GLP 和GLP 进行溶解度测试.结果显示，CM-GLP-H 的溶解度≥10 mg/mL，CM-GLP-M次之，CM-GLP-L最差，但溶解性优于GLP，说明经羧甲基修饰后，GLP溶解性有很大改善，并发现其溶解能力与羧甲基取代度呈正相关.红外光谱分析表明，CM-GLP具备多糖的特征吸收峰，1 604 cm-1和1 324 cm-1吸收峰的发现，说明（COO-）基团成功被连接到GLP上.

（3）体外抗氧化性分析显示，CM-GLP 的清除羟基自由基能力和还原力与CM-GLP 的浓度和取代度之间均呈正相关.