龙船花花药愈伤组织诱导研究

余惠文,左 梅,柯玲俊,王玉玲,陆銮眉*

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建 漳州 363000；2.闽台特色园林植物福建省高校重点实验室,福建 漳州 363000）

龙船花（Ixora chinensisLam）又名白日红、仙丹花、山丹花等，是茜草科（Rubiaceae）、龙船花属（IxoraLinn.）植物，龙船花花色艳丽、植株较矮，应用广泛[1]．茜草科龙船花属植物世界上约有400 种，其中大多数品种分布在热带地区，而我国主要分布在云南省和福建省等大部分地区，约有19 种[2]．龙船花花期比较长，花期从3月至12月份[3]，可用于鲜切花[4]和园林景观应用[5-6]，此外龙船花具有一定的药用价值[7].

花药愈伤组织诱导培养基的各种生长调节剂浓度组合、植物材料的基因类型、花蕾的生长发育时期、植物材料的预处理方法差异等培养条件都会对花药愈伤组织的诱导产生不同的影响[8]．龙船花组织培养和快速繁殖的相关研究为龙船花花药愈伤组织诱导积累了理论基础[9-11]．龙船花在生产上应用广泛，而相关育种研究相对滞后，尤其对其花药愈伤诱导相关研究未见报道．花药培养在植物育种中具有重要的用途，研究龙船花花药诱导愈伤的培养条件，建立龙船花花药诱导愈伤组织培养体系，有利于龙船花育种以及开展相应分子机理研究．因此，本研究应用不同植物生长调节剂浓度组合的培养基对两个不同品种的龙船花花药进行愈伤诱导，并探索低温预处理花药时间对愈伤诱导的影响，筛选出适合龙船花花药培养的诱导培养基以及低温预处理最佳时间．

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试验的龙船花品种为“杏黄龙船花”和“宫粉龙船花”（图1）．采集地点为闽南师范大学生物科学与技术学院植物园．

图1 本研究使用的龙船花品种Fig.1 Ixora chinensis accessions used in the study

1.2 实验方法

1.2.1 培养基制备

诱导培养的基础培养基为MS 培养基+蔗糖30 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1+琼脂8 g·L-1，分别添加不同浓度的2,4-D和KT，本研究设计了25组诱导培养基（表1），培养基的酸碱度调节至5.8．

表1 诱导培养基Tab.1 Induction medium with plant growth regulators(PGRs)

1.2.2 花穗取材及低温预处理

花穗取材一般在晴朗的早晨9∶00至11∶00摘取，选取单核中晚期、外观品质正常、无病虫害的龙船花花蕾，用枝剪将一整枝花团剪下，装入保鲜袋带回实验室．把摘下的花蕾放入密封袋，在4 ℃冰箱中低温预处理0、24、36、72 h后以备用，继而用O13培养基进行愈伤组织诱导．

1.2.3 花药接种

将花蕾置于体积为100 mL 的三角瓶里面，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75%乙醇浸泡30 s后，用无菌水冲洗1次；再用2%次氯酸钠溶液浸泡10 min后，浸泡过程中轻微振荡三角瓶，使其花蕾消毒彻底，最后用无菌水冲洗2至3次．把花蕾放在有无菌滤纸的培养皿里（挑选生长良好以及保存良好的花蕾）．选择处于单核期的个头饱满的、无破损的花药以备接种．在接种过程中，用灭菌后的镊子和解剖刀将花药轻轻剥开，然后接种到诱导培养基中，每个皿接种20粒．

1.2.4 培养观察及数据分析

将接种好的花药培养皿放入(27±1)℃条件下的培养箱进行暗培养．培养三天左右开始观察污染状况，分别观察培养3、4、5、6、7 d后的花药，排除污染、褐化以及其他原因导致死亡的花药，记录其花药诱导出愈伤组织所需的培养时间，20 d 后观察长愈伤组织的情况并统计数据，计算每个时间段愈伤组织的诱导率，然后每隔十天记录一次．分别统计20、30、40 d 时的愈伤组织数目并计算愈伤组织的诱导率，整理数据并分析结果．诱导率计算公式为

诱导率=产生的愈伤组织数/接种成活的花药数×100%．

2 结果

2.1 花药愈伤组织诱导

将生长状况良好且不同生长时期的花药进行分类，分别制片．用醋酸洋红染液进行染色在40×显微镜下观察，在花蕾长约为8 mm 时花粉发育时期处于单核期（图2A、B），并取该时期花药在MS 培养基＋蔗糖30 g·L-1＋活性炭0.5 g·L-1+琼脂8 gL-1+3 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1KT 培养基中进行接种培养．两种龙船花品种仅“杏黄龙船花”花药可诱导出愈伤，花药接种培养15 d 开始长出愈伤组织，愈伤组织比较光滑，呈半透明状．继续培养20 d后愈伤组织形状不规整，颜色较浅（图2C）．将愈伤组织转移到光照条件下培养，愈伤组织即转成绿色，整体质地较硬（图2D）.

图2 花粉发育时期观察Fig.2 Observation of pollen development period

2.2 不同浓度的植物生长调节剂组合对龙船花花药愈伤组织诱导的影响

用含不同浓度植物生长调节剂的培养基培养的“杏黄龙船花”花药均能诱导出愈伤组织，而“宫粉龙船花”均未诱导出愈伤组织．培养20 d时，“杏黄龙船花”花药愈伤的诱导率在2.80%～47.00%之间，培养30 d 时花药愈伤的诱导率在19.07%～69.44%之间，培养40 d 时花药愈伤的诱导率在26.67%～73.06%之间（表2）．在KT 浓度分别为0.2、0.5 和2 mg·L-1时，愈伤诱导率随着2,4-D 浓度的升高呈现先增加后减少的趋势，且均在2,4-D 浓度为4 mg·L-1时为峰值．在MS 培养基+4 mg·L-12,4-D+2 mg·L-1KT 诱导培养基中，培养20、30 和40 d 时龙船花花药愈伤诱导率均为最高，且40 d 时龙船花花药愈伤诱导率达到最高73.06%．不同浓度植物生长调节剂培养条件下诱导出的龙船花愈伤组织生活力旺盛，形态外观以及生长速率上没有明显差异.

表2 不同浓度的植物生长调节剂组合对花药培养的影响Tab.2 The influence of the medium with different concentrations of plant growth regulators on anther culture

续表2

续表2

2.3 低温预处理对花药愈伤组织诱导的影响

4 ℃条件下低温预处理不同时间对“杏黄龙船花”花药诱导愈伤效率的影响不同（表3）．龙船花花药经过4 ℃低温分别预处理0、24、48、72 h后，花药均能诱导出愈伤组织．预处理24 h的效果最佳，培养30 d和40 d的诱导率分别为67.78%和75.00%，40 d时愈伤诱导率显著高于未经低温预处理的诱导率．

表3 不同预处理时间对愈伤诱导的影响Tab.3 Effects of different pretreatments time on callus induction

3 讨论

龙船花应用广泛，是十分重要的园林观赏植物之一．花药培养技术已广泛用于十字花科[12]和禾本科[13-14]等农作物研究，本研究首次报道了龙船花花药诱导愈伤的研究，为龙船花育种以及基础研究提供理论参考．

利用花药培养诱导形成愈伤组织，不同材料的诱导成功率有很大差异[15]．马洪民等[16]对26个不同草莓品种进行花药培养研究时发现，草莓品种的基因型不同，其花药的离体培养，愈伤组织诱导能力上也有显著不同.26个草莓品种中只有9个品种诱导出愈伤组织.不同基因型在燕麦花药组织培养的影响表现为能否诱导出愈伤，诱导愈伤组织的多少等[17].由此可见，基因对花药培养效果起主要决定作用．相同培养条件下，“杏黄龙船花”均能诱导出愈伤组织，而“宫粉龙船花”未能诱导出愈伤，结果表明不同基因类型的供体材料对花药愈伤组织的诱导具有不同的影响.基因类型对龙船花花药愈伤组织的诱导作用是决定性的，与“宫粉龙船花”相比，“杏黄龙船花”为较易诱导花药愈伤的品种．

植物生长调节剂2,4-D 常用于诱导植物组织分化愈伤组织，矮生龙船花茎段在2,4-D 浓度为2 mg·L-1的培养基中产生愈伤组织[12]，“杏黄龙船花”花药诱导愈伤的适宜2,4-D 浓度则为4 mg·L-1．低温预处理有利于花药愈伤组织的形成在其它物种中多有报道[13-14,17-19]．郭新梅等[19]研究比较了基因型、低温预处理以及处理时间、及植物生长调节剂配比等因素对玉米花药培养效率的影响，研究表明适当的植物生长调节剂配比和低温预处理均可提高花药愈伤组织的诱导率．本实验研究结果与前人的研究结果类似，同一培养基条件下，龙船花花药在接种前进行适当的低温预处理，诱导率高于未经预处理时的诱导率，由此可见，适当的低温预处理有助于龙船花花药愈伤组织的诱导，“杏黄龙船花”花药在4 ℃低温预处理24 h 后愈伤组织诱导率显著高于未经低温预处理的诱导率．

综上，“杏黄龙船花”花药较易诱导产生愈伤组织，通过25 个处理组合试验筛选出MS 培养基（含30 g·L-1蔗糖+0.5 g·L-1活性炭+8 g·L-1琼脂）+4 mg·L-12,4-D+2 mg·L-1KT为诱导龙船花花药产生愈伤组织的最适培养基．“杏黄龙船花”花药在4 ℃低温预处理24 h可提高愈伤诱导率．