草果知母汤对戊四唑诱导癫痫大鼠海马神经元的保护作用及RECK/GFAP/AKT信号通路的调节作用

张高炼，郭建辉，曾 敬，李 敏，陈 锐，张晓宁，刘姗姗，梁韡斌

癫痫是由于大脑神经元异常放电进而引起大脑功能障碍的一种慢性疾病，流行病学研究资料显示，癫痫在发达国家的中位发病率约为45/10万，而在中低收入国家约为50.4/10万。据统计显示，发达国家癫痫病人的无故单次或多次癫痫发作发生率达到了50/10万～70/10万，在贫穷国家这一比例可能会更高。目前，我国的癫痫发病率与发达国家癫痫发病率基本保持一致。 研究发现，癫痫的发病机制与头部肿瘤、颅脑外伤、遗传因素等相关，且随着疾病进展，癫痫不仅危害病人生命安全，影响病人精神状态，还会导致病人发生认知功能障碍[1]，在儿童病人的临床表现中，癫痫对认知功能的影响则表现的更为明显。研究证实，癫痫导致的认知功能障碍及疾病进展与海马组织神经元损伤密切相关[2]。近年来不断有学者报道，反转录富含半胱氨酸蛋白(RECK)/胶质纤维酸性蛋白(GFAP)/蛋白激酶B(AKT)通路与颅脑损伤、抑郁及癫痫等脑部神经细胞受损疾病的预后转归及恶化进展均密切相关[3]。有研究发现，RECK/GFAP/AKT通路与海马组织细胞功能及神经元正常生理、生命活动密切相关[4-5]。本研究初步研究草果知母汤对戊四唑诱导的癫痫大鼠海马神经元的保护作用及RECK/GFAP/AKT信号通路的调节作用，为草果知母汤在癫痫疾病中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90只雄性SD大鼠，无特定病原体(SPF)级，8周龄，体质量180～200 g，购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 药品与试剂 草果知母汤由中药饮片(草果4.5 g，知母6 g，半夏9 g，厚朴6 g，黄芩4.5 g，乌梅4.5 g，花粉4.5 g，姜汁25 mL)煎制而成，生药含量为1 g/mL，购自北京同仁堂药业；丙戊酸钠(山东方明药业集团股份有限公司)；戊四唑(上海超研生物科技有限公司)；尼氏染色液(上海恒斐生物科技有限公司)；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)凋亡检测试剂盒(广州捷威斯生物科技有限公司)；聚合酶链式反应(PCR)引物设计及合成(上海信帆生物科技有限公司)；RECK抗体(亚科因生物技术有限公司)；GFAP(普健生物科技公司)；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、AKT购自碧云天生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 DMi8-M荧光倒置显微镜(徕卡显微系统贸易有限公司)；Sigma 3-18KS离心机(德国SIGMA公司)；SpectraMax iD3酶标仪(美谷分子仪器有限公司)；E-Gel Imager凝胶成像仪(赛默飞世尔科技公司)；S700/S700A石蜡切片机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；KEEBIO-VE186双垂直电泳槽(上海金鹏分析仪器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 癫痫大鼠造模、分组及给药方法 将大鼠随机分为正常对照组、癫痫模型组、草果知母汤低剂量组、草果知母汤中剂量组、草果知母汤高剂量组及阳性对照组，每组15只。除正常对照组外，其余大鼠按照35 mg/kg腹腔注射戊四唑[6]，每日1次，连续28 d，按照Recine[7]标准对大鼠进行分级，若大鼠连续5次出现Ⅱ级及以上癫痫症状，则视为造模成功。造模完成后，草果知母汤低、中、高剂量组大鼠按照2.5 mL/kg、5.0 mL/kg、10.0 mL/kg的剂量给予草果知母汤灌胃[8]，阳性对照组给予大鼠丙戊酸钠65 mg/kg灌胃[9]，对照组及模型组按照10 mL/kg灌胃生理盐水，每日1次，给药4周[9]。

1.4.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测大鼠海马组织Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平 取各组大鼠部分海马组织，用RNA提取试剂盒提取大鼠海马组织的总RNA，并将总RNA逆转录成cDNA，以GAPDH为内参，荧光定量PCR检测海马组织Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达。各基因引物见表1，结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1 各检测基因引物序列

1.4.3 尼氏染色法检测大鼠海马神经元尼氏小体 取各组大鼠海马组织，经石蜡包埋后进行4 μm切片，石蜡切片经二甲苯脱蜡后使用梯度乙醇脱水后，使用1%焦油紫染料室温孵育30 min，70%乙醇分色1 min，梯度乙醇脱水，DPX封片剂封片后在显微镜下观察，尼氏体呈紫色，细胞核呈淡紫色。

1.4.4 TUNEL染色法检测大鼠海马神经元凋亡水平 取大鼠海马组织，石蜡包埋切片，常规脱蜡处理，磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗两次，使用Proteinase K工作液室温反应30 min，PBS洗两次，加入预先制备好的TUNEL反应混合液，37 ℃的湿化室中孵育1 h，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，避光孵育15 min，使用荧光显微镜进行观察。计算细胞总数和凋亡细胞数并记录平均值，凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.4.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠海马组织RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平 取各组大鼠海马组织，在玻璃匀浆器中加入RIPA蛋白裂解液进行匀浆，以4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液，置于100 ℃沸水中水浴5 min变性，BCA法测定蛋白浓度后，取50 μg蛋白进行电泳分离，经转膜、封闭液封闭后，RECK、GFAP、p-AKT、AKT及GAPDH抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，PBST再次清洗3次，凝胶成像仪成像后，使用Image J 1.52v软件进行灰度值检测及分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠海马组织Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平比较 癫痫模型组大鼠海马组织Bcl-2 mRNA较正常对照组明显降低(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA较正常对照组大鼠明显升高(P<0.05)；与癫痫模型组比较，草果知母汤低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠海马组织Bcl-2 mRNA明显升高(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA明显降低(P<0.05)，且随着草果知母汤剂量的增加，癫痫大鼠海马组织Bcl-2 mRNA逐渐升高(P<0.05)，海马组织Bax及Caspase-3 mRNA逐渐降低。详见表2。

表2 各组大鼠海马组织Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平比较(±s)

2.2 尼氏染色法观察各组大鼠海马神经元尼氏小体 正常对照组大鼠尼氏小体数量正常，海马锥体细胞排列整齐，结构完整；与正常对照组比较，癫痫模型组大鼠及阳性对照组海马锥体细胞数量减少，排列分散，结构模糊，尼氏小体染色浅，尼氏小体大量丢失；与癫痫模型组比较，草果知母汤各剂量组尼氏小体染色丰富，锥体细胞结构完整，排列较整齐。详见图1。

图1 尼氏染色法检测各组大鼠海马神经元尼氏小体(A为正常对照组；B为癫痫模型组；C为草果知母汤低剂量组；D为草果知母汤中剂量组；E为草果知母汤高剂量组；F为阳性对照组)

2.3 各组大鼠海马神经元凋亡指数比较 癫痫模型组大鼠海马神经元凋亡指数较正常对照组明显升高(P<0.05)；与癫痫模型组比较，草果知母汤低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠海马神经元凋亡指数明显降低(P<0.05)，且海马神经元凋亡指数随着草果知母汤剂量的增加而逐渐降低。详见图2。

与正常对照组相比，＊P<0.05；与癫痫模型组相比，#P<0.05；与草果知母汤低剂量组相比，△P<0.05；与草果知母汤中剂量组相比，☆P<0.05。图2 各组大鼠海马神经元凋亡指数比较(A为荧光显微镜下观察；B为各组海马神经元凋亡指数比较的柱状图)

2.4 各组大鼠海马组织RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平比较 与正常对照组比较，癫痫模型组大鼠海马组织RECK及p-AKT水平明显降低(P<0.05)，而GFAP水平则明显升高(P<0.05)；与癫痫模型组比较，草果知母汤低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠海马组织RECK及p-AKT水平明显升高(P<0.05)，GFAP水平则明显降低(P<0.05)，且随着草果知母汤剂量的增加，大鼠海马组织RECK及p-AKT水平逐渐升高，GFAP水平则逐渐降低。各组大鼠海马组织AKT水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图3。

与正常对照组相比，＊P<0.05；与癫痫模型组相比，#P<0.05； 与草果知母汤低剂量组相比，△P<0.05；与草果知母汤中剂量组相比，☆P<0.05。图3 各组大鼠海马组织RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平比较(A为大鼠海马组织RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平表达条带图；B为各组大鼠海马组织RECK、 GFAP、p-AKT、AKT水平比较的柱状图)

3 讨 论

癫痫是目前临床上最常见的严重神经系统疾病，不但对病人身心造成严重伤害，也给病人家庭及社会带来负担，截至目前全球癫痫病人约有6 000万人。由于目前临床使用的抗癫痫药物治疗效果有限，接受药物治疗后缓解病人的复发率也缺少流行病学研究，需要进一步研究癫痫病人的发病机制，尤其是对突发性癫痫病人和已建立耐药性的癫痫病人进行深入研究及跟踪随访，并加速抗癫痫药物的研发。戊四唑诱导的癫痫大鼠模型是近年来实验室常用的建立实验室癫痫动物模型的一种方法，采用腹腔注射给予大鼠35 mg/kg戊四唑方法建立癫痫模型大鼠，安全性好且造模成功率高[10-11]。丙戊酸钠作为一种临床常用抗癫痫药物，其应用范围广且药理机制较明确，所以本实验使用丙戊酸钠作为阳性对照药物。

中医理论认为癫痫作为一种“痫病”，是由于脾肾亏虚及痰气郁结引起的气血津液运行不利，加之情志刺激，发为痫疾。中医药学者认为，对于痫病的治疗应以具有清肝利胆、活血安神、滋阴养液等功效的中药为主。草果知母汤出自《温病条辨》，中医学认为其具有燥湿清热等功效。方中草果具有温散湿浊之功效，厚朴、半夏、姜汁和胃化浊，知母、天花粉则能够清泻胃火养阴，黄芩及乌梅清肝泻火、敛肝生津，并防耗散阴津，诸药调和，起到燥湿清热的作用。现代药理学研究发现，其具有较强的抗癫痫作用，对于各种大发作、小发作均有明显效果[12]。在临床应用中，草果知母汤在癫痫的治疗中也已表现出明显效果。戴克银等[13]研究表明，草果知母汤在临床应用中表现出明显疗效，其能够明显改善癫痫病人的认知功能，减少发病次数，并改善精神状态及生活质量。张丽萍等[14-16]研究发现，草果知母汤对癫痫大鼠具有一定的神经元保护作用，并能够调节海马组织凋亡基因及抗凋亡基因的表达。Bax、Bcl-2及Caspase-3基因都是与细胞凋亡过程相关的重要基因，其中，Bcl-2作为抗凋亡基因抑制细胞的凋亡，而Bax 及Caspase-3则为促凋亡基因，能够诱导细胞凋亡。本实验通过建立戊四唑诱导的癫痫大鼠模型，并给予癫痫大鼠不同剂量的草果知母汤，结果表明，草果知母汤低、中、高剂量组大鼠海马组织Bcl-2 mRNA水平逐渐升高，而海马组织Bax及Caspase-3 mRNA水平则逐渐降低，提示草果知母汤能够呈剂量依赖性地促进Bcl-2的表达，抑制Bax 及Caspase-3的表达，调节海马组织细胞凋亡相关基因的表达，进而抑制海马神经元凋亡，发挥海马神经元保护作用。

海马组织是大脑认知、学习及记忆能力的功能组织。研究发现，在由癫痫导致认知功能障碍的病理进展中，海马神经元对其疾病进展及预后起到至关重要的作用[17]。同时海马组织相关蛋白通路的变化又能够影响海马神经元的正常生理活动，所以，通过调节海马神经元凋亡相关基因水平及多种细胞生命活动所必需的蛋白通路进而发挥对海马神经元的保护作用，是目前治疗癫痫引起的认知障碍药物研发的思路之一。本实验研究结果表明，给予癫痫模型大鼠不同剂量的草果知母汤后，大鼠海马组织病理学明显改善，同时癫痫大鼠海马组织神经元凋亡率明显降低，提示草果知母汤能够修复癫痫大鼠海马组织尼氏小体损伤，降低海马组织神经元损伤凋亡，保护并修复戊四唑诱导的癫痫大鼠海马神经元损伤。

GFAP被证明是与癫痫大鼠神经损伤密切相关的蛋白。癫痫病人的脑损伤病理进展与星形胶质细胞有关，星形胶质细胞会随着脑损伤的病理变化进而出现以肥硕与增生为主要特征的反应性细胞，而GFAP则是该反应性细胞的主要标志蛋白。GFAP是癫痫脑损伤状态的标志物，同时又是癫痫引起脑损伤疾病进展的标志，并反映抗癫痫药物的治疗效果。卢万可等[18]研究表明，癫痫大鼠脑损伤是GFAP表达升高，而抑制GFAP的过表达则能够起到降低大鼠脑损伤的作用。RECK基因由20个外显子及21个内含子组成，是互补DNA编码的膜锚定糖蛋白，共有971个氨基酸组成，近年来研究表明，其在头颈部肿瘤及乳腺癌等疾病的发病机制中起到重要作用，并能够通过影响基质金属蛋白酶等机制参与血管生成、组织重塑、细胞增殖、凋亡等生命活动[19-21]。Du等[3]进一步研究发现，癫痫大鼠海马组织损伤与RECK蛋白表达异常有关，通过激活RECK蛋白的表达能够降低大鼠海马组织损伤；AKT通路参与了癫痫发病过程中神经元异常放电及病理形成过程，AKT通路活化则能够促进神经元的修复，抑制神经元的凋亡及损伤。张思远等[22]研究表明，激活癫痫大鼠脑组织PI3K/AKT信号通路及相关蛋白能够调节凋亡相关基因的表达，进而起到抗癫痫及保护海马神经元的作用。本实验结果表明，草果知母汤各剂量组大鼠海马组织RECK及p-AKT蛋白水平升高，GFAP水平降低，而海马组织AKT蛋白水平无明显变化，提示草果知母汤能够呈剂量依赖性地促进癫痫大鼠海马组织RECK及p-AKT的表达，抑制GFAP水平，推测草果知母汤能够通过抑制海马神经元病理性变化，同时促进AKT蛋白的磷酸化水平，并促进细胞增殖，表明草果知母汤能够通过调节RECK/GFAP/AKT通路，进而发挥其神经元保护作用。

综上所述，草果知母汤能够降低戊四唑诱导的癫痫大鼠海马神经元凋亡，调节凋亡相关基因表达水平，其机制可能与调节RECK/GFAP/AKT信号通路有关。由于时间及资金条件的限制，本实验未能考察草果知母汤对癫痫大鼠RECK/GFAP/AKT信号通路的靶向调节作用，在今后的实验中将对上述问题做进一步的阐述说明。