铁死亡在子宫内膜异位症中的研究进展

彭佩轩，王莉

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种雌激素依赖性的常见妇科疾病，常引起盆腔疼痛、痛经和不孕[1]。EMs 虽为良性疾病，却有着恶性疾病的行为学特征，如侵袭、血管生成和远处转移。EMs 的发病机制尚无明确定论，从1927 年Sampson 提出的“经血逆流”学说，到血行、淋巴转移与体腔上皮化生学说，再到我国学者提出的“在位内膜决定论”，解释和补充了不同类型EMs 的发病机制[2]；而随着免疫学、分子生物学的发展，EMs 的发病机制研究也逐渐拓展到更深的层次，如炎症反应、免疫应答和细胞代谢等。这些多层次的研究与假说更加证明了EMs 发病机制的多元性。

在对EMs 患者异位、在位内膜与非EMs 女性在位内膜的比较中发现，EMs 患者的在位与异位内膜在基因表达、代谢水平及对不同信号分子的反应方面都有所差异，铁代谢异常也成为近年来发现的异位内膜的一个特征性表现。细胞内铁过载诱发氧化应激、激活巨噬细胞的清除作用，在正常细胞中诱导程序性细胞死亡，即铁死亡（ferroptosis）。EMs 患者的内膜组织可表现为对铁死亡的抵抗，这种异常代谢可能与内膜组织中某些铁死亡通路上的基因异常表达有关[3]。而盆腔中铁过载又可损伤间皮细胞，促进异位内膜细胞的迁移和血管生成，从而参与EMs 的发生、发展。

1 铁过载与铁死亡

铁是维持人体稳态的重要金属元素，参与多种重要的生理过程，如血红蛋白合成、氧运输、核酸的复制和修复等。2012 年Dixon 等提出了“铁死亡”概念，定义为一种铁依赖的细胞程序性死亡，在形态学、生物化学以及遗传学上区别于已知的细胞程序性死亡，如凋亡、坏死和自噬等，其以活性氧（reactive oxygen species，ROS）积聚以及脂质过氧化导致细胞死亡为特征，并受到细胞内铁代谢、脂质代谢和氧化还原水平的调控。

铁死亡的发生依赖于细胞内铁代谢紊乱，细胞内游离二价铁（Fe2+）增多，与过氧化氢发生芬顿反应（Fenton reaction），使氧合血红蛋白（Fe2+）变为高铁血红蛋白（Fe3+）产生ROS（如超氧自由基和羟基自由基），间接促进一系列自由基成分生成，导致膜脂质的过氧化。膜脂质中多聚不饱和脂肪酸和磷脂酰乙醇胺是过氧化的重要靶点。膜磷脂的过氧化破坏膜的流动性和稳定性，膜通透性增加，细胞容易裂解死亡；脂质过氧化的衍生物亦可引发蛋白质-核酸交联，干扰细胞内蛋白质功能，引发细胞死亡。铁死亡在电子显微镜下可表现为线粒体密度增高、嵴减少、线粒体膜损伤，细胞因能量代谢失衡而死亡。作为细胞内重要的抗氧化系统，谷胱甘肽代谢与铁死亡调控密切相关；硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase，GPX4）是细胞内最关键的抗脂质过氧化酶，亦是铁死亡调控的核心。GPX4 通过催化还原型谷胱甘肽将过氧化氢还原为水，清除自由基，并参与过氧化脂质的还原反应，修复生物膜中的过氧化脂质，防止铁死亡的发生。Xc-系统是调节谷胱甘肽代谢的重要转运通道，主要由催化亚基溶质载体家族7 成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）及伴侣亚基SLC3A2 组成，将胱氨酸转入细胞内或利用转硫途径直接生成半胱氨酸，为还原型谷胱甘肽的合成提供原料。辅酶Q10 作为内源性亲脂性抗氧化剂，是甲羟戊酸代谢过程中的衍生物之一，阻止脂质过氧化保护细胞免受铁死亡；甲羟戊酸途径中的另一中间产物异戊烯焦磷酸则可将硒元素整合到硒蛋白（如GPX4），从而发挥抗氧化、抑制铁死亡的作用。铁死亡在许多疾病（如肿瘤，神经退行性疾病，心脏、肾脏及生殖系统的缺血再灌注损伤）中均发挥一定作用，研究铁死亡在不同疾病中的作用机制、实现铁死亡的调控，为上述疾病的诊治提供了前景[4]。关于铁死亡在EMs 中的研究虽尚不多见，但有研究提示铁死亡在EMs 的发生、发展及其导致的不孕、恶变等过程中有重要作用。如何通过调节铁死亡来控制疾病的预防和发展、如何通过铁死亡相关的基因或分子标志实现疾病的早期诊断仍亟待解决。

2 EMs 与铁死亡

2.1 EMs盆腹腔环境铁过载1927 年Sampson 提出的“经血逆流”学说直到现在仍被认为是EMs 病因的经典学说，异位种植的内膜在激素刺激下周期性出血，吸引巨噬细胞吞噬红细胞并释放大量血红蛋白，铁的大量输送超出巨噬细胞内铁蛋白储存和螯合金属的能力，导致盆腔血红蛋白及铁含量升高；EMs 患者子宫内膜存在二价金属离子转运蛋白1（divalent metal-ion transporter 1，DMT1）的过度表达，DMT1 通过将Fe2+转运至细胞内导致病灶中铁过载[5]。EMs 患者的腹腔液、异位内膜病灶、腹膜及巨噬细胞中都有铁过载现象[6]，其中铁离子、转铁蛋白、铁蛋白、血红蛋白、炎症因子及促血管生成因子等含量均高于非EMs 患者[7]。EMs 患者盆腔高铁的微环境可直接诱导氧化应激反应及ROS 的产生，其水平与EMs 的严重程度呈正相关[8]。ROS 磷酸化核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制蛋白（IκB），激活ROS-NF-κB 通路，提高基质金属蛋白酶表达，促进异位内膜播散[9]，破坏局部腹膜间皮细胞，为异位的内膜细胞提供黏附位点，并参与异位内膜的恶变[10]。过量铁离子亦可募集巨噬细胞，诱导巨噬细胞将异位内膜作为待修复的损伤组织，促进异位细胞存活和组织内血管生成[11]。近年越来越多的证据也表明，以铁过载及脂质过氧化为特征的铁死亡在EMs 的发生及发展中发挥着重要作用。

2.2 铁死亡与EMs

2.2.1 异位内膜对铁死亡抵抗 研究者通过比较EMs 患者和正常女性在位与异位内膜的基因表达差异，发现EMs 患者无论在位还是异位内膜，与铁死亡抵抗相关的基因都发生上调，从而影响异位内膜的清除[3]；近期也有研究证实铁死亡抵抗参与了子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells，ESC）的增殖与迁移[12]，机制之一可能与ESC 伴随的细胞外糖蛋白纤维蛋白1（fibulin 1）表达上调有关[13]。其中，转铁蛋白表达上调、铁自噬体相关基因核受体共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）表达下调、铁蛋白表达下调，通过降低胞内游离Fe2+浓度增强异位内膜细胞对铁死亡的承受能力。电压依赖性阴离子通道2（voltage dependent anion channel 2，VDAC2）是线粒体外膜转运代谢物质的重要通路[14]，作为参与细胞内还原反应的重要基因调节ROS 代谢，促进铁死亡，其表达在异位内膜组织中显著下调。SLC3A2 是胱氨酸转运通道Xc-系统的伴侣亚基，其在异位内膜组织中表达上调，使细胞内合成还原型谷胱甘肽的原料——胱氨酸水平升高；因此，SLC3A2 过表达导致GPX4 的底物还原型谷胱甘肽合成增加，减少铁死亡的发生。与脂质过氧化有关的花生四烯酸15-脂氧合酶（arachidonic acid 15-lipoxygenase，ALOX15）、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1，SAT1）、长链脂酰辅酶A 合成酶5（long-chain acyl-CoA synthetase 5，ACSL5）和溶血卵磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）基因在异位内膜细胞中的表达均下调，通过抑制脂质过氧化逃避铁死亡。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）对铁死亡的表观调控与EMs 也有关，异位内膜中lncRNA ADAMTS9-AS1 显著上调，通过微小RNA（microRNA，miRNA）-6516-5（miR-6516-5）/GPX4通路抑制铁死亡，加速ESC 增殖与迁移[12]；lncRNA肺腺癌转移相关转录物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在异位内膜细胞中的表达也上调，敲低MALAT1 则可在ESC 中通过miR-145-5p/MUC1 信号通路促进抑酯酶素（erastin）诱导铁死亡[15]。EMs 这一特征提示铁死亡可能是正常人体内异位内膜的清除机制，这一过程的失衡导致了EMs 的发生，并促进其蔓延；这些差异性表达的基因及产物也为EMs 的诊治提供了新的分子标志及治疗靶点。

2.2.2 铁死亡与脂质代谢失调 EMs 患者中患有高脂血症者占有一定的比例，且远期动脉粥样硬化及高血压的患病率高于非EMs 患者[16]。异位内膜细胞中脂质代谢活性强、低密度脂蛋白及胆固醇水平增加，提示EMs 患者参与胆固醇生成的甲羟戊酸途径可能有较高的活性。在胆固醇的生成途径中，羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）经HMG-CoA 还原酶还原并脱去辅酶A 生成甲羟戊酸，其代谢衍生物辅酶Q10 及中间产物异戊烯焦磷酸又可通过不同机制清除细胞内脂质过氧化物，抑制铁死亡。他汀类药物可通过抑制HMG-CoA 还原酶活性抑制EMs 患者ESC 的生长和侵袭[17]，可能与间接导致辅酶Q10及异戊烯焦磷酸减少，细胞内脂质过氧化诱发铁死亡有关。他汀类药物治疗EMs 的临床试验很少，有临床试验提示服用辛伐他汀与注射促性腺激素释放激素激动剂相比，对EMs 术后患者疼痛的控制率相似[18]，但该试验样本量较小，且缺乏仅手术治疗与术后接受药物治疗病例的对比。如何通过改变脂质代谢状态抑制EMs 的发生、发展仍需进一步研究。

2.2.3 铁死亡与血管生成 Mori 等[19]研究显示，在卵巢内膜样囊肿中ESC 通过上调转铁蛋白受体1和下调转铁蛋白增加对过量铁离子的摄取，保护内膜上皮细胞免受铁过载引发的氧化应激，ESC 又可通过多腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1，PARP1]/去乙酰化酶1（sirtuin-1，SIRT1）信号通路激活细胞自噬，减轻因自身铁过载导致的生长抑制[20]。卵巢型EMs 囊肿内侧囊壁因与囊液直接接触，囊液中陈旧性血液富含的高浓度铁离子、脂质过氧化物及ROS 诱发内侧囊壁ESC 发生铁死亡，进而激活p38 丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/信号转导与转录活化因子6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）信号通路引起血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）旁分泌，从而促进周围EMs 病灶生长，而在外侧囊壁却未观察到这一现象；铁死亡抑制剂N-乙酰半胱氨酸能通过其抗氧化作用使EMs 病灶消退[21]。但铁死亡诱导剂抑酯酶素也表现出对EMs 病灶的清除作用，并伴随铁外排蛋白（ferroportin）表达下调[22]，提示铁死亡在EMs 病理过程中有两面性。ESC 增加铁离子摄取保护上皮细胞免受铁过载导致的氧化应激及铁死亡等伤害，内层ESC 铁死亡又可旁分泌VEGF、参与调节免疫机制，从而促进病灶的生长与迁移；两者相辅相成，共同参与EMs 的病理过程。铁死亡激活和抵抗在EMs 病灶中共存，提示铁死亡或许是治疗EMs 的一把双刃剑，如何把握铁死亡这一机制在EMs 中的平衡仍需进一步探讨与研究。

3 铁死亡与EMs 相关性不孕

腹腔液和卵泡液是配子发育和胚胎受精、着床过程中的重要微环境，EMs 患者腹腔液及卵泡液均表现出铁过载及与ROS 有关的代谢产物增多[6]，诱发铁死亡，损伤精子、卵细胞及早期胚胎，减少受精及胚胎植入成功的概率。早在20 世纪90 年代就有研究发现，EMs 患者腹腔液的铁离子浓度较高，EMs 患者腹腔液处理过的精子顶体反应发生率降低，且与铁离子浓度成反比，提示EMs 患者腹腔液对精子体外顶体反应的发生可能有决定性作用[23]；暴露在铁离子环境中的巨噬细胞亦表现出对精子吞噬作用的增强，并产生对生殖细胞的杀伤作用[24]。卵细胞质量在一定程度上取决于线粒体功能及细胞内平衡氧化应激水平的酶活性[25]，EMs 患者的成熟卵细胞中线粒体特征性损伤及氧化应激增加，导致其在发育及受精过程中停止发育并退化[26]，证实铁死亡参与了卵细胞损伤；重度EMs 患者的卵泡液中转铁蛋白不足及铁过载亦可诱发小鼠卵细胞成熟障碍[27]。EMs 患者盆腔内氧化与抗氧化系统失衡所致的持续炎症反应对生殖细胞及胚胎均有毒性作用，盆腔内促炎状态又可改变子宫内膜的容受性，从而影响精卵识别；或通过增加始基卵泡的募集及窦前卵泡的闭锁减少卵巢储备[28]。EMs 患者的腹腔液因铁过载对其处理过的体外培养小鼠胚胎产生一定的胚胎毒性，其毒性可被铁死亡抑制剂ferrostatin-1（fer-1）中和，提示铁死亡与EMs 相关性不孕联系密切。EMs 患者腹腔液处理过的小鼠胚胎表现为GPX4 表达降低、脂质过氧化增加，从而引发铁死亡干扰囊胚的形成；小鼠胚胎铁死亡伴随着促炎基因血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）过表达，增加铁聚集诱导铁死亡[29]。线粒体损伤在EMs 导致的不孕机制中也占有关键地位，小鼠胚胎体外实验中铁死亡过程引发的线粒体损伤表现为腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水平降低、ROS 升高及线粒体膜电位超极化，抑制植入前小鼠胚胎发育[30-31]。现有结论提示，不同类型铁死亡抑制剂或许能通过降低细胞内铁离子、氧化应激水平及避免线粒体损伤导致的能量障碍，维持精子、卵细胞和早期胚胎的正常代谢过程，降低不孕的概率。铁死亡通路可以作为未来治疗不孕的潜在药物抑制靶点。

4 结语与展望

铁死亡作为近年研究的热点，在EMs 的发生和发展中不可或缺。近年研究显示，异位子宫内膜通过基因异常表达与对脂质代谢的调控逃避铁死亡的清除作用，病灶中的ESC 又通过铁死亡释放炎症介质和促血管生成物质诱发局部血管生成及盆腹腔内免疫、炎症反应和间皮损伤，促进EMs 病灶的迁移及侵袭。由此可见，虽然铁死亡在EMs 发生中已有确定作用，但铁死亡的发生和抑制在EMs 中存在着一定的动态平衡，如何把握铁死亡的调控方向仍需进一步研究，并可通过观察不同程度地抑制或激活铁死亡对EMs 病灶的影响实现。最新研究多集中于ESC中铁死亡抵抗的调节通路及抑制铁死亡对EMs 病灶的影响，多种miRNA、自噬通路等均参与这一过程，提示miRNA 及自噬通路潜在的调节作用，而miRNA作为潜在的血清学标志物，提示铁死亡通路相关miRNA 在EMs 早期诊断中的价值。他汀类药物调节脂质代谢通路对EMs 的治疗价值仍缺乏足够的临床研究证据；通过抑制铁死亡是否可以逆转EMs 患者盆腔高铁环境产生的胚胎毒性仍需进一步体外及体内研究。铁死亡通路相关的基因及表达产物亦为EMs 的诊断提供了潜在的生物标志及治疗靶点，并为EMs 及其相关性不孕的治疗提供了新思路。