超高液相色谱串联质谱测定磷酸肌酸钠中磷酸甲酯*

陈慧芳，刘 毅，刘为中

(1 安庆医药高等专科学校，安徽 安庆 246052；2 合肥医工医药有限公司，安徽 合肥 230601)

药品并非纯净物质，在其生产和贮运过程中会引入和产生杂质。其中，具有潜在致癌性的杂质更是杂质研究和控制的重点[1]。这些具有人体DNA结构直接或间接损伤，继而产生基因突变或体内诱变而具有致癌可能或者倾向的物质为基因毒性杂质(Genotoxic Impurity，GTI)。目前，许多法规机构如ICH、FDA等都对GTI有了明确的要求，其中ICH也针对基因毒性杂质制定了M7指导原则[2-5]。

缺血性心肌病是心肌处于长期缺血致使心肌组织弥漫性纤维化的临床综合征，心衰是缺血性心肌病发展到一定阶段的必然表现，会导致心功能迅速下降[6-7]。磷酸肌酸是人体内自由的活性物质，专为ATP补充能量。磷酸肌酸钠是其药用形式，可作为治理缺血性心肌损害、室性心律失常以及改善心衰的重要辅助药物。但是在合成磷酸肌酸钠原料药的过程中，可能涉及潜在GTI的遗传毒性杂质。朱永琴等研究人员对其中磷酸三乙酯、肌酸磷酸二乙酯、肌酐磷酸二乙酯检测进行了报道[8]，岛津仪器公司对肌酸磷酸二甲酯、肌酸酐磷酸二甲酯、肌酸磷酸二乙酯、肌酸酐磷酰二乙酯检测进行了报道，但是对磷酸甲酯均未见报到。本文才用超高效液相色谱-串三重四级杆质谱法，建立了磷酸肌酸钠中磷酸甲酯的含量测定方法，为磷酸肌酸钠的质量控制提供了参考依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

甲醇(色谱纯)，霍尼韦尔公司；磷酸甲酯(对照品，批号：AL170628-19)，斯坦福化学公司；磷酸肌酸钠(批号：191001),合肥医工医药；实验用水为自制超纯水。

1.2 仪器与设备

LC-30A超高效液相色谱仪；三重四级杆质谱仪LCMS-8050连用系统，岛津仪器公司；电子天平，赛多利斯仪器公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备

取磷酸甲酯对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液浓度为 30 μg/L。

2.1.2 供试品溶液制备

取磷酸磷酸肌酸钠适量，精密称定，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，加水溶解并定量稀释制成每1 L约含磷酸肌酸钠50 mg的溶液，摇匀，即得。

2.1.3 色谱条件

Shim-pack Gist C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，2 μm)；流动相(水-甲醇)；流速(0.35 mL/min)；柱温(40 ℃)；进样体积2 μL。

表1 梯度时间程序Table 1 Gradient time series

2.1.4 质谱条件优化

LCMS-8050接电喷雾离子源，采用正离子化模式；雾化器流量：3.0 L/min；接口电压：4.5 kV；加热器流量：10.0 L/min；接口温度：300 ℃；DL温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃；干燥器流量：10.0 L/min；驻留时间：10ms。采用ESI+模式进行全扫描确定磷酸甲酯母离子，通过PIS扫描确定定量离子，并对该离子碰撞能量进行优化。采用动态多反应监测模式(MRM)分析磷酸甲酯，得到质谱参数如下：监测离子对(141.10>79.10)，Q1 Pre(-10.0 V)，CE(-23.0 V)，Q1 Pre(-17.0 V)。磷酸甲酯的MRM色谱图见图1。

图1 磷酸甲酯的MRM色谱图Fig.1 MRM Chromatogram of methyl phosphate

2.1.5 线性实验

精密吸取“2.1.1”项下制备的对照品溶液0.2 mL、 0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL、2.2 mL分别置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。按照优化后的方法进行测定，以浓度和峰面积进行回归，绘制标准曲线。结果表明，磷酸甲酯的回归方程为A=75524.05C-3328.17(A为峰面积，C为样品浓度,μg/L)，在0.6～7.2 μg/L线性范围内呈良好线性关系，相关系数为0.9998。

2.1.6 检测限测定

取“2.1.5”项下梯度稀释的对照品溶液，按照优化后的方法进行测定，测得检测限浓度为0.16 μg/L。

2.1.7 精密度测定

取同一对照品溶液重复测定6次，计算RSD为0.57%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 加样回收率实验

分别取6份磷酸磷酸肌酸钠10 mg，精密称定，精密加入对照品溶液适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液进行测定，测得平均回收率为97.17%，相对标准偏差为0.94%，表明本法准确性较好。结果见表2。

表2 加样回收率实验Table 2 sample recovery experiment

2.2 样品测定

取供试品溶液分别按照优化后的方法进行测定，计算各样品中磷酸甲酯含量。结果表明，6批样品中均未检出磷酸甲酯。

3 结 论

磷酸肌酸钠的合成路线如下：

磷酸肌酸钠合成反应第二步中使用磷酸水解开环，磷酸与溶剂甲醇反应生成磷酸甲酯，该化合物属于致癌警示结构中的磷酸酯类，因此为潜在基因毒性化合物。

本研究建立了超高效液相色谱-串三重四级杆质谱法快速测定磷酸肌酸钠中磷酸甲酯含量的方法。利用该方法测定磷酸甲酯的检测限为0.16 μg/L，平均加样回收率为97.17%，相对标准偏差为0.94%，方法灵敏准确，为磷酸肌酸钠质量控制提供了可靠的依据。