不同品系小鼠哮喘模型的建立与比较*

章谦男，肖 欢，李劳冬，孙起翔，徐思月，李超乾△

（广西医科大学第一附属医院 1.急诊科；2.呼吸内科，南宁 530021）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种慢性非特异性气道疾病，气道炎症、气道黏液高分泌、气道高反应性及气道重塑是其特征性表现[1]。随着气候与环境的恶化，其发病率逐年升高，目前已成为严重危害人类生命健康的危险因素[2]。鉴于人体试验的局限性，目前主要通过哮喘动物模型来进行哮喘相关的研究。理想的动物模型要尽可能体现人类哮喘的病理生理机制，包括变态反应性炎症、Th1/Th2细胞比例失衡、嗜酸性粒细胞增多、气道分泌大量黏液等[3]。BALB/c 和C57BL/6 小鼠作为常用的哮喘模型实验动物，主要有以下特征：遗传背景明确、品系多、价格便宜且易诱发哮喘特征性症状[4]。本研究旨在建立并比较BALB/c和C57BL/6小鼠哮喘模型的差异，为哮喘相关研究提供方法学参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级BALB/c雄性小鼠和C57BL/6雄性小鼠各12只，5～6周龄，体重18～20 g，购自长沙天勤生物技术有限公司[SCXK（湘）2019-0014]。本次实验使用广西医科大学实验动物中心屏障动物实验设施，经广西医科大学动物实验伦理委员会批准（IACUC-202006004），并严格遵循3R原则。

1.2 主要试剂与仪器 鸡卵清蛋白（OVA，美国Sigma公司）；氢氧化铝佐剂（大连Meilunbio公司）；NOD样受体蛋白3（NLRP3）抗体（北京Bioss公司）；caspase1 抗体（英国Abcam 公司）；凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、GAPDH抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；白介素（IL）-4、干扰素（IFN）-γ 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉Cusabio 公司）。MK3 型全波长酶标仪购自美国Thermo 公司；CX41-32 型正置荧光显微镜购自日本Olympus 公司；CN-100型医用压缩雾化器购自广东粤华器械厂有限公司。

1.3 分组与造模 12只BALB/c小鼠和12只C57BL/6小鼠随机分为对照组和哮喘组，每组6 只。哮喘组分别于0 d、7 d、14 d 腹腔注射含25 μg Ⅴ级OVA 和1 mg 氢氧化铝佐剂的PBS 混悬液0.2 mL，自21 d起，每天雾化吸入20 mL 的OVA（20 g/L）30 min，连续7 d，激发小鼠哮喘。对照组给予等量的无菌PBS。

1.4 哮喘症状评分[5-6]27 d 时观察经OVA 激发哮喘后20 min内小鼠上呼吸道症状（打喷嚏和头面部搔抓动作）及哮喘症状并进行评分。上呼吸症状评分标准：（1）0分：无喷嚏或搔抓；（2）5分：1～3次喷嚏或搔抓；（3）10 分：4～6 次搔抓；（4）15 分：7 次及以上。哮喘症状评分标准：（1）0 分：无症状；（2）3 分：有轻微喘息；（3）6分：出现深快呼吸、躁动或静伏等症状；（4）9 分：表现出明显的腹式呼吸等特征性的哮喘症状。

1.5 血清IL-4 和IFN-γ 含量测定 眼球内眦取血，4 ℃下离心，取上清，采用ELISA法测定血清IL-4和IFN-γ含量。

1.6 支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞涂片及分类计数 用0.5 mL 4 ℃无菌PBS 轻柔灌洗肺脏3 次，收集BALF。回收的BALF 在4 ℃条件下以1 000 r/min 离心10 min，分离沉淀和上清。用1 mL PBS 重悬沉淀，细胞计数板统计每毫升的细胞总数；剩余沉淀涂片行瑞氏染色，在光学显微镜下计数200 个细胞以确定细胞分类。

1.7 肺组织病理学观察 取小鼠左肺，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，制备肺组织石蜡切片，分别行苏木精—伊红（HE）染色和过碘酸雪夫（PAS）染色。观察气道周围炎症细胞浸润与杯状细胞分布，并进行病理学评分[7-8]。炎症评分标准：无炎性细胞浸润为0分，气管周围炎性细胞层＜1个、≥1个、2～4个、＞4个分别为1分、2分、3分、4分。气道杯状细胞占比评分，0 分：无杯状细胞；1 分：＜25%杯状细胞；2分：25%～50%杯状细胞；3分：50%～70%杯状细胞；4分：＞75%杯状细胞。

1.8 免疫组化法检测肺组织炎性小体表达 取肺组织石蜡切片，脱蜡、水化后用柠檬酸盐高压抗原修复，10%山羊血清封闭非特异性抗原；加入兔抗NLRP3（1∶200）、caspase1（1∶250）、ASC（1∶200）4 ℃下孵育过夜，加入二抗（1∶100）室温孵育2 h；DAB显色，苏木精复染，1%盐酸酒精分化后脱水、封片。光学显微镜下观察，按染色程度评估肺组织炎性小体表达：无着色为阴性，淡黄色为弱阳性，浅褐色为阳性，深褐色为强阳性。

1.9 Western blotting 法检测肺组织炎症小体的表达情况 取小鼠肺组织，加入裂解液于冰上充分裂解，离心，取上清，BCA法检测蛋白浓度；SDS-PAGE分离蛋白，将分离的蛋白转至硝酸纤维素膜上；室温封闭30 min，洗膜，加入一抗NLRP3（1∶1 000）、caspase1（1∶1 500）和ASC（1∶1 500）4 ℃孵育过夜；洗膜，加入荧光二抗（1∶1 000）室温孵育1.5 h，洗膜，用LI-COR Odyssey system扫膜。应用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白表达量。

1.10 统计学方法 使用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘急性发作症状 在激发过程中，BALB/c哮喘组和C57BL/6 哮喘组均出现打喷嚏及头面部搔抓动作，进而哮喘症状逐渐加重。BALB/c 哮喘组小鼠出现呼吸减慢、腹肌抽搐、点头呼吸、行为迟滞和反应迟钝等表现，而C57BL/6 哮喘组小鼠则表现得较为自如，偶可见自发活动减少与呼吸急促等表现。BALB/c 哮喘组与C57BL/6 哮喘组上呼吸道症状评分与哮喘症状评分均高于相应对照组（均P＜0.05），此外BALB/c 哮喘组相较于C57BL/6 哮喘组上呼吸道症状评分增高（P＜0.05），两对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 不同品系小鼠哮喘症状表现 ±s，n=6

表1 不同品系小鼠哮喘症状表现 ±s，n=6

与BALB/c 对照组比较，*P＜0.05；与C57BL/6 对照组比较，#P＜0.05；与C57BL/6哮喘组比较，△P＜0.05。

2.2 各组BALF 中细胞总数和嗜酸性粒细胞数比较 与相应对照组比较，BALB/c哮喘组和C57BL/6哮喘组BALF中细胞总数和细胞质内嗜酸性粒细胞（粗大、整齐的砖红色颗粒）增多，且BALB/c哮喘组多于C57BL/6哮喘组（均P＜0.01），见图1。

图1 各组BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞数比较

2.3 各组血清IL-4 和IFN-γ 含量比较 BALB/c 哮喘组血清中IL-4 浓度增高，IFN-γ 浓度降低，与BALB/c 对照组和C57BL/6 哮喘组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；而C57BL/6 哮喘组与C57BL/6 对照组血清IL-4 和IFN-γ 含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 各组血清IL-4和IFN-γ含量比较

2.4 肺组织病理学形态 HE染色显示：BALB/c哮喘组气道壁充血水肿，黏膜基底层增厚，管壁周围及血管周围有大量炎症细胞浸润，管腔狭窄，与BALB/c哮喘组比较，C57BL/6哮喘组病理学改变减轻。两对照组气道黏膜完整，无炎症细胞浸润（图3A）。PAS染色显示：BALB/c哮喘组支气管周围大量黏液分泌，杯状细胞增生明显，与BALB/c哮喘组比较，C57BL/6哮喘组气道中仅少量杯状细胞增生，而两对照组几乎未见黏液分泌及杯状细胞增生（图3B）。BALB/c 哮喘组与C57BL/6 哮喘组炎症评分和气道杯状细胞占比评分均高于相应对照组（均P＜0.01），两对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图3 小鼠肺组织HE染色和PAS染色结果（×200）

表2 气道周围炎症评分及气道杯状细胞占比评分 ±s,n=6

表2 气道周围炎症评分及气道杯状细胞占比评分 ±s,n=6

与BALB/c对照组比较，**P＜0.01；与C57BL/6对照组比较，##P＜0.01；与C57BL/6哮喘组比较，△△P＜0.01。

2.5 各组肺组织NLRP3、caspase 1 和ASC 蛋白表达比较 免疫组化结果显示：BALB/c 哮喘组肺组织中NLRP3、caspase 1 及ASC 蛋白呈强阳性表达，主要见于气道上皮细胞与炎症细胞中，C57BL/6 哮喘组肺组织NLRP3、caspase 1 及ASC 蛋白表达较BALB/c 哮喘组减弱，两对照组中上述蛋白主要呈弱阳性或不表达，见图4。

图4 免疫组化检测炎症小体相关蛋白表达（×400）

Western blotting结果显示：与相应对照组比较，BALB/c 哮喘组与C57BL/6 哮哮喘组肺组织NLRP3、caspase 1 和ASC 蛋白表达量升高（均P＜0.01）；与BALB/c哮喘组比较，C57BL/6哮喘组中炎症小体相关蛋白表达量降低（P＜0.01），两对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

图5 各组肺组织炎症小体相关蛋白表达量比较

3 讨论

哮喘是一种由过敏原引起的慢性非特异性呼吸道疾病，其中气道慢性炎症是其本质特征[9]。嗜酸性粒细胞在哮喘炎症反应的启动和传播中起着至关重要的作用[10]，Santus 等[11]研究表明，外周嗜酸性粒细胞数量增加的哮喘患者病情更为严重。本研究发现，BALB/c 哮喘组相较C57BL/6 哮喘组BALF 中炎症细胞总数与嗜酸性粒细胞数量增多，且在激发时表现出呼吸减慢、点头呼吸、腹肌抽搐等严重的哮喘症状，这与Morokata 等[12]的研究结果相似。以上结果表明在同样条件下，BALB/c 小鼠可能更易诱发出严重的哮喘病情。Th1/Th2失衡在哮喘的发病过程中发挥着重要作用[13]，辅助型T2细胞（Th2）分泌的IL-4可促进B淋巴细胞分泌抗原特异性IgE 并可促进嗜酸性粒细胞的产生与聚集，进而影响哮喘慢性气道炎症反应[14]。辅助性T1 细胞（Th1）所分泌的IFN-γ 可抑制IL-4 的生成、IgE 合成及嗜酸性粒细胞的浸润[15]。本研究中，与BALB/c对照组比较，BALB/c 哮喘组血清IL-4 含量增多，IFN-γ 含量减少；而C57BL/6 哮喘组与其对照组比较差异无统计学。通过对两品系哮喘组进行比较，发现BALB/c 哮喘组能够优势性地反应出Th1/Th2失衡。表明在同样的造模条件下BALB/c小鼠更易表现出哮喘特征性的Th2炎症反应[16]。肺组织病理形态学变化是评价哮喘造模成功的重要指标之一，本研究病理学结果显示，与C57BL/6 哮喘组比较，BALB/c 哮喘组气道管腔狭窄，周围炎症细胞浸润明显，杯状细胞增生并分泌大量黏液，提示BALB/c哮喘组肺组织病理学改变显著，与既往研究结果[17]相似。结合其特异性的哮喘症状、大量嗜酸性粒细胞浸润、Th1/Th2失衡及肺部病理损伤等情况，本组可以看到BALB/c小鼠经OVA致敏激发后对于哮喘表现得更为易感，两品系间的哮喘表现具有差异性。

NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC和caspase1组成，其激活后可促进炎症细胞因子的释放，从而诱发各类炎症反应[18]。相关研究显示，通过干预机体NLRP3 炎性小体的激活，可抑制Th2 炎症反应、减轻哮喘的气道高反应性、气道重塑和肺部炎性反应[19-20]。越来越多的证据表明NLRP3激活与哮喘发病机制密切相关[21]。本研究发现，两哮喘组NLRP3、ASC、caspase1 蛋白表达均上调，且BALB/c 哮喘组与C57BL/6 哮喘组比较有差异。NLRP3 炎症小体是诱导哮喘小鼠肺部Th2型过敏反应的关键因素[22]。结合BALB/c 哮喘组血清中高水平IL-4 和低水平IFN-γ 所诱导的哮喘特异性Th2 炎症反应，在相同造模条件下，本组猜测造成两品系间病理表现及气道炎症等造模结果差异可能与异常激活的NLRP3炎症小体有关。然而，NLRP3炎症小体在两品系哮喘模型间的具体作用机制还需继续深入研究。

综上所述，本研究在同等条件下诱导的两品系小鼠哮喘模型均获成功，但综合比较之下BALB/c哮喘组肺组织病理改变、嗜酸粒细胞浸润及血清IL-4水平改变均更为明显，特别是NLRP3、ASC 和caspase 1 含量提高；两品系哮喘模型间差异可能与异常激活的NLRP3炎症小体有关，但具体机制仍有待进一步的研究。