16q缺失调节miR-3145-5p/CYP2E1表达对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡及患者预后的影响*

邱龙凤，卢玉飞，吴圣明，木和·穆罕默德，胡启平,3△

（1.广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室，南宁 530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院影像诊断中心，南宁 530021；3.广西医科大学长寿与老年相关疾病教育部重点实验室，南宁 530021）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种起源于肝细胞、最常见的肝脏恶性肿瘤，但其发病机制尚不清楚[1]。染色体片段缺失是人类实体癌的共同特征，其缺失通常代表了驻留在缺失区域内的特定肿瘤抑制基因失活[2]。已有研究表明，癌症患者的染色体缺失与患者的不良结局之间存在密切的联系[3]。其中染色体16q 片段不同程度的缺失在多种癌症中均有发现，但其具体影响机制尚不明确。本课题组前期研究发现，75 例广西HCC 患者中有约50%的患者癌组织中存在16q 缺失，但未对16q 缺失影响HCC 发生发展的机制作进一步的分析[4]。miRNA 是一种非编码小RNA，参与细胞增殖、新陈代谢、分化和凋亡等关键生物学过程的调节[5]，在HCC 诊断、预后和治疗等方面发挥的作用已被证明。然而，16q 缺失及其差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）在HCC 中的研究尚未深入。本研究旨在探索HCC 中16q 缺失对患者预后的影响及其相关的miRNAs和关键DEGs，为临床HCC的治疗和预后提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 TCGA数据收集 从TCGA数据库中获取TCGA-LIHC 数据集，包含全转录组数据（372 个HCC样本和50 个非肿瘤样本）和16q CNV 数据（缺失片段筛选阈值为Mean_Log_Ratio≤-0.25）[6-7]。

1.2 miRNAs 及关键靶基因的筛选 基于TCGALIHC 全转录组数据，使用DECenter 筛选出与HCC 16q 缺失相关的miRNAs 和DEGs。通过miRWalk(http://miRwalk.umm.uni-heidelberg.de/)预测miRNAs 与关键DEGs 的表达调节关系。在TCGA-LIHC 数据库和Kaplan-Meier Plotter 数据库中获取关键DEGs 在HCC 中的表达图谱以及对患者生存影响图谱。

1.3 免疫组织化学染色法检测关键蛋白表达水平

根据HPA 数据库获取HCC 患者癌组织及其癌旁组织关键蛋白（CYP2E1）的免疫组织化学染色图，按照组织化学评分法（H-score）进行评分，Hscore=∑pi（i+1），其中pi 为阳性细胞数占切片中所有细胞数量的百分数，i代表着色强度。

1.4 细胞培养和转染 人肝癌细胞株Huh7（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。将miRNA 过表达（mimic）慢病毒载体LV-hsa-miR-3145-5p、对照慢病毒载体con294（上海吉凯基因科技有限公司）分别转染HCC 细胞株，即miR-3145-5p mimic组、NC-con294组。

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR） 提取细胞总RNA，miRNA 采用加尾法进行逆转录，mRNA 逆转录采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）试剂盒。定量试剂均采用TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）试 剂 盒。GAPDH用作待测基因的内参，U6用作miRNA的内参。采用2-ΔΔCt法计算miRNA/mRNA 相对表达量。引物序列如下：miR-3145-5p上游：5’-CGCGAACTCCAAACACTCAAAACTCA-3’；U6 上游:5’-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3’；所有通用下游引物均由TaKaRa公司提供。

1.6 Western blotting法检测CYP2E1蛋白表达

细胞贴壁长满后，使用RIPA Lysis Buffer 裂解细胞，冰上裂解30 min 后，12 000 r/min 离心5 min，收集上清；采用BCA 法测定蛋白浓度，煮沸变性，SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗CYP2E1（1∶1 000，Abcam）、β-actin（1∶1 000，Absin）4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，二抗（1∶5 000，Absin）室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 显色、曝光，蛋白凝胶成像仪（SGC2020126，ChampChemi 610 Plus）进行显影，保存图像后，用Image J软件进行定量分析。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖 细胞计数后，将转染后的Huh7细胞株（3×103个/孔）接种于96孔板，按照CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度值。

1.8 细胞克隆形成实验 将稳定转染的Huh7细胞株接种于6孔板中（1×103个/孔），置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，培养皿中出现肉眼可见的克隆团时终止培养。使用4%组织细胞固定液和结晶紫溶液，按照试剂说明书对细胞克隆团进行染色，晾干后进行计数并分析。

1.9 细胞侵袭实验 向Transwell小室中加入200 μL用新鲜无血清培养基稀释的Huh7 细胞（3×104个/孔），下室中加入600 μL含10%FBS完全培养基，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。使用4%组织细胞固定液和结晶紫溶液，按照试剂说明书对小室进行染色。计算侵袭细胞数。

1.10 细胞划痕实验 取对数生长期细胞并计数，将转染后的Huh7细胞株（1.5×106个/孔）接种于6孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞平铺长满后进行划痕，并于同一位置不同时间段（0 h 和24 h）进行拍照，计算划痕愈合率，划痕愈合率=（0 h划痕面积－24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.11 细胞周期和细胞凋亡检测 取对数生长期、生长状态良好的细胞，分别按照细胞周期检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）和细胞凋亡检测试剂盒（MULTI SCIENCES）说明书步骤，采用流式细胞仪进行检测和分析。

1.12 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行处理，正态分布的资料组间比较采用t检验，偏态分布的资料采用秩和检验；以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 320 个DEGs 与16q 缺失和肿瘤发生、发展相关 根据TCGA-LIHC数据集中16q CNV数据和全转录组数据，筛选出320个与16q缺失和肿瘤发生、发展相关（相对于癌旁组织，在癌组织中上调或下调的基因）的DEGs（其中169 个上调、151 个下调），其中19个DEGs位于16q上，且均为下调DEGs（表1）。通过DAVID 对DEGs 进行KEGG 通路富集分析，综合考虑P值和富集倍数，发现其主要富集于“细胞色素氧化酶P450代谢有害异物”、“化学致癌”和“药物代谢—细胞色素氧化酶P450”通路（图1A），相关DEGs 包 括UGT2B10、GSTM1、UGT1A1、ADH1C、ADH1B、UGT2B15、UGT2B17、CYP3A4、HSD11B1、ADH4、AKR7A3、GSTA2、CYP1A2、CYP1A1、UGT1A4、UGT1A3、CYP2E1、UGT2B7、UGT2B10、NAT2和AOX1；然而，16q 上所有DEGs 并不在上述通路中。进一步分析DEGs中细胞色素氧化酶P450表达发现，当16q 缺失时13 种CYP 中有9 种表达下调（CYP11A1、CYP2A6、CYP 17A1、CYP2E1、CYP1A1、CYP8B1、CYP3A4、CYP1A2和CYP39A1），即16q缺失可能通过减弱有害异物的代谢使细胞表型更加恶化。

表1 16q上与16q缺失相关基因的差异表达

利 用Cytoscape、MCODE 和cytoHubba 分 析DEGs 之间相互作用关系发现12 个关键基因（图1B）存在较强的相互作用关系，其中下调关键DEGs（CYP3A4、UGT1A1、CYP2E1、AOX1和CYP1A1）中有3 个是CYP（表2）。随后，根据TCGA-LIHC 与Kaplan-Meier Plotter 数据库，将CYP2E1 在HCC 患者癌组织和正常（癌旁）组织中相对表达水平以及对患者的生存影响进行了分析，与癌旁组织比较，HCC 癌组织CYP2E1 mRNA 相对表达量降低（图1C）；HPA数据库免疫组织化学结果显示，与癌旁组织比较，CYP2E1 蛋白表达在HCC 组织中下调（图1D）。生存分析显示，在HCC患者中，CYP2E1低表达组患者生存率低于CYP2E1高表达组（图1E）。

表2 Cytoscape、MCODE 和CytoHubba 分析16q 缺失相关DEGs的关键基因

图1 16q缺失相关DEGs通路分析和DEG（CYP2E1）表达及其对患者预后的影响

2.2 miR-1226-3p、miR-3145-5p可能调控CYP3A4、CYP2E1表达根据TCGA-LIHC 中miRNA 和CNV 数据，筛选出8 个16q 缺失相关的差异表达miRNAs（miR-483-5p、miR-483-3p、miR-3145-5p、miR-1226-3p、miR-378d、miR-4788、miR-204-3p 和miR-204-5p），其中miR-483-5p、miR-483-3p、miR-3145-5p 和miR-1226-3p 表达上调、miR-378d、miR-4788、miR-204-3p 和miR-204-5p 表达下调；进一步用miRWalk 筛选上述miRNAs 的靶基因，预测结果发现16q 缺失后CYP3A4 和CYP2E1 等2 个关键DEGs可能与miR-1226-3p 和miR-3145-5p 等2 个DEmiRs存在表达调节关系。

根据CYP的平均表达值（AveExpr）、DEmiRs筛选时的效应量（effect size）、P值和靶基因的预测关系，本选择miR-3145-5p和CYP2E1的表达调控关系及其对HCC 细胞行为的影响来验证16q 缺失对HCC预后的影响。

2.3 miR-3145-5p mimic 对miR-3145-5p 基因和CYP2E1 蛋白表达的影响与NC-con294 组比较，miR-3145-5p mimic 组miR-3145-5p 表达 上调，CYP2E1 的蛋白表达水平下调（P＜0.01），见图2。

图2 miR-3145-5p mimic对miR-3145-5p基因和CYP2E1蛋白表达的影响

2.4 miR-3145-5p mimic 对Huh7 细胞增殖和细胞周期的影响 在miR-3145-5p mimic转染Huh7细胞后，与NC-con294 组比较，miR-3145-5p mimic 组细胞增殖和侵袭能力增强，细胞凋亡率升高（均P＜0.01），没有发现明显的细胞周期阻滞现象，两组细胞迁移能力比较亦无明显差异（P＞0.05），见图3、图4。

图3 miR-3145-5p mimic对Huh7细胞增殖和细胞周期的影响

图4 miR-3145-5p mimic对Huh7细胞侵袭、迁移和凋亡的影响

3 讨论

HCC 是全球癌症死亡的常见原因，其基因组、表观遗传和转录改变对HCC的发生发展、转移和预后发挥着关键作用[8-9]。另外，16q 片段不同程度的缺失已在KBG综合征[10]、乳腺癌[11]、前列腺癌[12]等多种癌症中出现，并且在癌症的发生发展和预后中发挥了一定作用，然而目前尚未在分子水平上对16q缺失与HCC的发生发展关系进行探讨。

有496个基因定位于16q 上，但在16q缺失的患者癌组织中，只有其中19 个基因发生了差异表达（均为下调表达）。本研究筛选出320个与16q缺失相关的DEGs，这些DEGs 主要富集于“细胞色素氧化酶P450代谢有害异物”、“化学致癌”和“药物代谢—细胞色素氧化酶P450”通路，但16q 上的19 个DEGs 均未在上述通路中，可见16q 缺失影响HCC细胞的表型可能是通过影响16q以外基因（如CYP）表达来实现的。与16q缺失相关的13种CYP中有9种表达下调，并且其中3 种（CYP3A4、CYP2E1和CYP1A1）下调CYPs 是蛋白-蛋白相互作用较强的hub基因。

CYP2E1 是一种Ⅰ相毒物代谢酶，参与药物代谢以及大脑生物活性过程，具有解毒作用，与多种疾病和病理生理状况有关[13]，其中，较高的CYP2E1活性与二乙基亚硝胺诱导的HCC发生相关，而抑制CYP2E1 活性可降低DEN 对肝细胞的增殖、肝损伤和HCC 的发生[14]。本研究根据TCGA-LIHC、HPA和Kaplan-Meier Plotter 等数据库分析发现，相对于正常组织，HCC 癌组织中CYP2E1在mRNA 和蛋白水平表达都是下调的，且CYP2E1低表达对患者的生存是不利。CYP3A4 是CYP3A 亚家族中研究最多的异构体，负责CYP3A 亚家族的大部分代谢活动，免疫反应性强，分布范围广，是当前HCC治疗的预后标志[15-16]。因此，16q 缺失可能通过下调CYP2E1和CYP3A4表达来减弱有害异物的代谢使细胞表型更加恶化。

随后筛选出8 个16q 缺失相关的DEmiRs，并预测其中miR-3145-5p 与CYP2E1、miR-1226-3p 与CYP3A4和CYP2E1存在表达调节关系。已有研究表明，miR-1226-3p 通过下调DUSP4 表达促进HCC索拉非尼敏感性[17]，还可调节ITGB1进而促进HCC细胞增殖和侵袭[18]。而miR-3145-5p在HCC中的作用及机制目前尚无研究报道。经本研究推测，16q缺失可能通过miR-3145-5p、miR-1226-3p 下调CYP2E1和CYP3A4表达使细胞表型更加恶化，进而使HCC患者预后不良。

根据CYP的表达值和DEmiRs筛选时的效应量P值等因素，本研究选择miR-3145-5p和CYP2E1的表达调控关系及其对HCC 细胞行为的影响来验证16q 缺失对HCC 预后和生存的影响。实验结果表明，HCC 细胞中miR-3145-5p 可在mRNA 和蛋白水平下调CYP2E1的表达，并促进HCC 细胞的增殖和侵袭；在对细胞凋亡的影响方面，miR-3145-5p mimic 可使细胞凋亡增加，但可能细胞增殖速度相较于细胞凋亡的速率快，故细胞总体呈增殖状态，此效应对HCC 细胞的恶性表型的影响有待进一步研究。结合CYP2E1的功能及其表达对患者生存的影响以及miR-3145-5p和CYP2E1的表达调节关系，本组推测在16q 缺失的HCC 患者中，上调的miR-3145-5p 和miR-1226-3p 等miRNAs 可能靶向下调CYP2E1和CYP3A4的表达，尤其是miR-3145-5p 通过下调CYP2E1表达来促进HCC 细胞的增殖和侵袭而进一步增加细胞的恶性表型，促进HCC 发展，降低患者预后。

为了更进一步了解16q 缺失与HCC 发生发展的相关机制，还应进一步在荧光素酶实验、更多HCC 细胞系（株）和在动物水平上分析miR-1226-3p、miR-4788 和miR-378d 等miRNAs 与CYP2E1和CYP3A4的表达调节关系及其对HCC恶性生物学行为的影响，为HCC 的诊断、治疗提供更加有效的依据。

总之，本研究通过综合生物信息学分析对16q缺失相关的差异表达miRNAs及差异表达基因进行筛选，并通过基因、蛋白水平以及细胞水平对其进行验证，发现16q 缺失可能增强HCC 相关miRNAs（miR-1226-3p、miR-3145-5p）及其靶基因（CYP3A4和CYP2E1）的表达调控，进而影响HCC细胞的恶性生物学行为，导致HCC 患者的不良预后。综上所述，DEGs（CYP2E1和CYP3A4）和DEmiRs（miR-1226-3p 和miR-3145-5p），尤其是miR-3145-5p 和CYP2E1，可能是预测HCC 患者16q 缺失预后的生物分子标志物，可作为16q缺失HCC患者潜在的治疗靶点。