大鼠肝脏组织不可逆电穿孔消融能量效应和热效应研究

朱金俊， 黄伟伟， 包家立， 胡亚楠

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要仪器

清洁级Sprague-Dawley大鼠（浙江省医学科学院实验动物中心提供），平均体质量200 g。所有实验过程均符合我国《实验动物管理条例》有关条规。

实验仪器主要有电脉冲系统OX4-5型电穿孔仪（杭州场皿科技公司），脉冲电场发生的简要示意电路如图1所示，由电源、电容器组、开关和脉冲控制器、并行电阻及负载组成；YP5008G型多路温度记录仪（深圳永鹏仪器公司）。

图1 脉冲发生电路

1.2 IRE消融

电脉冲处理前以1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将脉冲发生器、电极针进行连接，用铁架台固定电极针，针间距为5 mm；大鼠以躺姿固定于手术台，手术区域消毒并暴露肝脏；将电极垂直插入大鼠肝中，施加电脉冲。实验分为11组，脉冲个数分别为10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140个，每组总能量分别为5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70 J。脉冲释放结束后将脏器回纳腹腔，常规闭腹并消毒。

1.3 实时温度测量

通过热电偶测温仪分别测量肝脏组织在电脉冲暴露时的实时温度。热电偶放置的测量点如图2所示。共设置15个测量点，测量点1～5放置于电极针中上侧，间距为2.5 mm；测量点6～10放置于电极针右侧，间距为2.5 mm；测量点11～15放置于电极针的右下侧，间距为2.5 mm。

图2 热电偶仪测量点示意图

1.4 病理检查

饲养3 d后，对大鼠行安乐死。将肝组织置于4%甲醛溶液中浸泡48 h，石蜡包埋，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，制成组织切片并行苏木精-伊红（HE）染色，通过Olympus VS200数字切片扫描仪进行扫描，获得病理学彩色扫描图。通过ImageJ软件进行消融面积计算。

1.5 温度仿真

表1 仿真参数

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析结果，以均值±标准误表示，n=3，取平均值进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 8软件绘制图表。

2 结果

2.1 IRE引起肝脏消融的病理组织学观察

组织消融情况如图3所示，消融区域边界清晰。消融1区域是插入深度约为2 mm、直径为0.35 mm的电极针所在区域；2区域是靠近电极的组织被热损伤区域，肝组织结构消失，呈现均匀的红色染色固化状态，中心电极温度达到组织热固定阈值（图3②）；3区域肝组织结构保留，但肝核消失，肝窦扩张，显示有Kupffer细胞残留（图3②④）；4区域是修复与再生结合区，大量肉芽组织形成，5区域中肝细胞轻度受损，呈细胞水肿状态（图3③）。电场暴露引起的消融部位邻近血管和胆管仍保留完整（图3⑤）。

图3 肝脏消融3 d后组织学所见

2.2 IRE能量效应

实验发现，电脉冲能量＜20 J时肝脏组织消融面积随能量逐步增加，最大消融面积约为30 mm2；电脉冲能量＞20 J后，肝脏组织消融面积不再继续增大（图4）。不同能量的组织HE染色切片代表图如图5所示。

图4 能量与肝脏组织消融面积关系

图5 不同能量组织HE染色切片代表图（10×）

2.3 IRE热效应

大鼠肝脏温度15个测量点（图2）实时数据如图6所示，实验发现在能量为0.5 J、释放频率为1 Hz电脉冲下，肝脏温度在50 s内快速上升，在50～150 s进入缓慢上升，在150～200 s温度趋于稳定（图6①）；在能量为0.25 J、频率为1 Hz和0.5 J，频率为0.5 Hz电脉冲作用下，肝脏温度在100 s内上升，在100～200 s温度趋于稳定（图6②③）。用Sim4Life软件根据具体电脉冲参数对大鼠肝脏温度分布进行仿真（图7），可见距离电极越近的区域，温度越高；电极针附近等温线接近圆形，随着距离增加逐渐变成葫芦状，最终呈椭圆形分布；越靠近电极，温度变化率越大。将15个测量点仿真温度和实验测量最终温度进行对比，数值高度吻合（图8）。

图6 不同参数脉冲暴露下肝脏温度实时变化曲线

图7 不同参数脉冲暴露下肝脏仿真温度分布图

图8 电脉冲作用下测量最终温度和仿真温度对比

3 讨论

IRE消融技术是除了射频消融［15-16］、微波消融［17-18］、光热 消融［19］、激光消 融［20］、冷 冻消融［21-22］之外另一种良恶性肿瘤消融方法，具有可应用于血管、胆管、胰管和神经等重要组织结构附近良恶性肿瘤消融的优势［23］，也可使肝血管肝门得以保留［24］。IRE已成为肝门等重要结构附近良恶性肿瘤安全消融治疗的手段之一。然而，IRE在组织消融中的能量效应和热效应仍有待进一步研究。本研究通过观察IRE处理后肝脏组织病理学切片发现，肝脏消融区域与周围组织有明显分界，且区域内细胞发生凝固性坏死，这说明IRE能引起肝组织消融并限定在一定范围，提示IRE应用于肝脏组织消融的有效性；同时发现IRE在组织消融过程中可避开邻近血管和胆管，具有保护敏感部位优势（图3⑤），这提示只要给予的能量合适，IRE对于重要结构周围良恶性肿瘤的消融具有安全性。

目标组织温度高于45～50℃这一“致死温度范围”20 s后组织就会被高温破坏［13］。本实验中采用0.5 J单脉冲能量，以0.5 Hz频率进行释放，实时测量目标组织温度变化，最高温度位于5号测量点处，约为40℃，比实验前提高约10℃（图6③）。通过测量不同电参数IRE处理时肝脏组织温度实时变化，均发现温度逐渐上升，并最终趋于稳定；在相同脉冲频率下，当能量增加时，组织温度也会相应增加（图6①②），同时在相同能量条件下，当脉冲频率增加时，组织温度也会相应增加（图6①③）。根据电脉冲具体参数进行温度分布仿真模拟发现，其与实验得出的最终温度高度吻合（图8）。实验和仿真结果共同表明，IRE治疗过程中热效应是存在的，所以需要在手术前根据电脉冲体参数充分预测IRE暴露后组织热量分布。

本研究旨在探索IRE在大鼠肝脏组织消融中的能量效应和热效应，结果显示消融部位肝脏组织发生凝固性坏死，消融区域与周边组织存在明显分界，血管胆管未见明显损伤。IRE在肝脏消融中存在能量效应，并可得出对应的能量效应经验公式，同时IRE也会引起组织热效应。因此，应在术前优化电参数，确定IRE最优能量，并避免产生热损伤。