无卵黄冷冻液冷冻食蟹猴精液方法的优化

陈衍高江梅赵世坤李比海饶军华*杨世华*

(1.华南农业大学兽医学院,岭南现代农业广东实验室,广州 510260;2.广东省科学院动物研究所,广东省动物保护与资源利用重点实验室,广东省野生动物保护与利用公共实验室,广州 510260)

超低温冷冻是一种较为有效的保存方式,被广泛应用于农业、医学等领域的种质资源保存[1-3]。自Bunge等[4]使用冷冻复苏后的精子获得成功妊娠以来,精子冷冻技术为雄性保留生殖能力做出了巨大贡献。由于精子冷冻保存过程中精子冷冻损伤、冷休克、氧化损伤等原因,冷冻保存的精子复苏率较低[5-6]。由于鸡卵黄具有抗冷休克和冷冻保护作用,含有卵黄的精子冻存液使用极为广泛,但卵黄可能含有病原体,具有生物安全风险[7]。Quinn’s和Origio两种无卵黄冻存液已被人类精子库和生殖医学中心所采用。前者产自美国SAGE公司,主要成分有10 mg/mL HSA、甘油、庆大霉素和一些无机盐、氨基酸等。后者产自丹麦,其主要成分为HSA、重组人胰岛素和10μg/mL的硫酸庆大霉素。这两种无卵黄冻存液,避免了动物性传染病以及不能被定量的标准成分所带来的固有变化[8]。但是,这两种冻存液是否可用于非人灵长类精子保存仍待证实。

食蟹猴(Macaca fascicularis)是我国二级重点保护动物,常作为生殖研究和疾病模型研究的实验动物[9-11]。利用食蟹猴研究并开发有效的精子冷冻方法,可为保存其他濒危或具有重要意义的非人灵长类物种精液提供参考[12]。例如,本团队成功构建了Shank3基因突变的自闭症模型食蟹猴,有效的精子保存方法对于大量制备突变序列相同的突变猴群及疾病模型群至关重要[10]。

因此,本实验利用两种不同的无卵黄冻存液冷冻食蟹猴精子并优化关键冷冻步骤。通过精液冷冻后活率、精子复苏率和顶体完整率确定两种无卵黄冻存液的最佳使用条件,并进一步证实精浆对精子冷冻的保护作用,以期为保护非人灵长类种质资源提供一种安全有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6只健康成年普通级雄性食蟹猴,体重(7.57±0.56)kg,购自广州相观生物科技有限公司【SCXK(粤)2018-0043】。以上动物均饲养于广东省科学院动物研究所【SYXK(粤)2018-0187】。本实验所有程序均由广东省科学院动物研究所伦理委员会批准(GIZ20210312)。饲养环境:温度16～26℃,湿度40%～70%,光照周期明暗均为12 h。实验期间动物定时喂食和自由饮水。

1.1.2 主要试剂与仪器

若无特殊说明,所用试剂均来自Sigma公司。Origio和Quinn’s无卵黄精子冻存液(SAGE,Coopersurgical)于4℃保存。以Tris-卵黄为基础的精子冷冻稀释液TTE被用于对照组,此培养基每10 mL包括Tris-HCl 0.02 g,TES 0.12 g,Glucose 0.2 g,Lactose 0.2 g,Raffinose 0.02 g,Streptomycin 0.0005 g,Penicillin-G 0.000063 g和卵黄2 mL[13]。配制完成后-80℃保存,使用前,添加10%甘油。精子稀释液成分表见表1。

表1 精子稀释液Table 1 Sperm diluent

1.2 方法

1.2.1 精液收集和处理

本实验对食蟹猴进行阴茎电刺激采集精液(见图1),在清醒的状态下将食蟹猴保定于猴椅。每只猴至少采集3次,每次间隔3 d以上,从6只猴采集28份精液样本。精液样本置于37℃下保存30 min,使其充分液化。将精子稀释液加入至精液中,直至每毫升精液混合物的精子密度为每毫升2×106条。3066 rpm离心5 min,洗涤2次。每次洗涤完成后,去掉上清,并吸取适量精子洗涤液小心重悬。洗涤结束后,进行常规分析及冷冻保存。在冻存前每份样本需取20μL分别用于精子活率及顶体完整率的检测。

图1 精液采集的设备与方法Figure 1 Equipment and method of semen collection

1.2.2 排精量及精液密度、运动度、畸形率及顶体完整率评估

吸取1μL新鲜液化精液,加入99μL等温精子稀释液稀释后滴加到预热的计数板上,加热致死后在光学显微镜下计数25个大方格中左上、右上、左下、右下及正中5个方格的精子数量,根据公式:精子密度=5个方格精子总数×5×原始精液倍数×104,计算出精子密度。另取10μL洗涤后的精子混合液滴加到预热的血球计数板上,在光学显微镜下计数向前运动和不运动的精子。每次至少计数200个,重复2次,计算运动精子百分比即为精子运动度[14]。

另取10μL洗涤稀释后的精液滴加到载玻片上,滴加4%的甲醛溶液固定、风干后,观察精子的头部、颈部及尾部是否有畸形,如弯折、卷曲、带有原生质滴,计数后计算精子畸形率。另外用精子稀释液将精液样品洗涤、离心并稀释到适当浓度后取20μL滴在载玻片上,滴加4%的甲醛固定,风干后滴加10μg/mL的Alexa Fluor 488 conjugate覆盖,在湿盒中37℃避光孵育30 min。孵育完成后,用PBS洗去多余染料,在荧光显微镜下检查,其激发光波长和发射光波长分别为488 nm和530 nm,顶体完整的精子被染成均匀的苹果绿色,而顶体不完整的精子部分着色或不着色。计数顶体完整的精子和顶体不完整的精子,计算顶体完整率。操作步骤参考相关文献报道[15-16]。

1.2.3 精子冷冻及实验设计

Origio和Quinn’s为商品化冻存液,冻存步骤参考产品说明书。Origio:将精子冻存液于室温预温2 h后,用精子冻存液与洗涤稀释后的精液按1∶0.5、1∶1和1∶1.5的比例进行稀释。将混合物在室温下保持10 min,随后分装至冷冻麦管。在距离液氮表面0.5、5和10 cm 3个不同高度悬挂冷冻麦管30 min。最后,将麦管移至液氮中保存。Quinn’s:将精子冻存液提前置于室温下,用精子冻存液与精液按1∶0.5、1∶1和1∶1.5的比例进行稀释后将混合物浸入装有水的烧杯中,置于4℃冰箱缓慢降温1.5 h,在距离液氮表面0.5、5和10 cm 3个不同高度悬挂冷冻麦管30 min,最后投入液氮冷冻保存。TTE:冻存步骤参考文献报道[17]。用预热至37℃的TTE稀释液将样品稀释,并将混合物浸入装有水的烧杯中,置于4℃冰箱缓慢降温2 h。随后向稀释精液中加入等体积、预冷至4℃、含有10%甘油的TTE冷冻液。TTE冷冻液分5次加入,每次加入1/5,加1次间隔1 min。将稀释精液分装至4℃的冷冻麦管中。在距液氮面上方5 cm处冷冻10 min后投入液氮保存。

精浆对精子冷冻保存的影响实验设计:将每个个体的精液样本分为2等份,3066 rpm离心5 min。随后,1份保留精浆,1份不保留精浆。按1.2.3中所述的Quinn’s的实验方法,将精液与冻存液1∶1混合。缓慢降温结束后,将保留精浆组与不保留组每组分别分装3管,在距液氮面5 cm高度处悬挂30 min后放入液氮保存。

1.2.4 冷冻精子复苏及复苏率的计算

将冷冻麦管从液氮取出后,立即放入37℃水浴锅中1 min,剪断麦管两端收集冷冻精液。经洗涤后,参照文献[18]公式计算,即复苏率(%)=解冻后运动度/冷冻前运动度×100。

1.3 统计学分析

所有数据以平均值±标准差(±s)表示,精子活率、复苏率及顶体完整率等百分比数据在分析前均经过平方根的反正弦转换。探讨精浆对精子冻存影响的数据分析采用配对t检验,其余则经完全随机设计的单因素方差分析(One way Anova)及最小显著差法(LSD)检验数据间的差异显著性,P＜0.05则判定为差异显著。以上所有数据的处理均通过Graphpad prism 6.0软件完成。

2 结果

2.1 食蟹猴精液基本情况

28份精液样本被用于本实验。6只成年食蟹猴精液量(0.41±0.39)g,精子密度每毫升(4.53×109±4.20×109),精子活率(80.68%±8.15%)、畸形率(15.59%±12.03%)及顶体完整率(82.46%±14.99%)。精子顶体染色及评价见图2。

图2 精子顶体荧光染色及评价Figure 2 Spermatozoal acrosome staining

2.2 液氮面不同悬挂高度对食蟹猴精子冷冻复苏的影响

28份精液样本被用于本实验,统计结果如表2所示。健康猴精液与两种冻存液按照说明书混合平衡后活率未表现出明显差异。当悬挂高度为5 cm时,两种冻存液均表现出相对较好的保护效果,并与0.5、10 cm高度相比差异显著。而同为5 cm的高度下,与Origio相比,Quinn’s复苏率较高且差异显著。顶体完整率各组之间无差异。

表2 两种冻存液在不同悬挂高度下冷冻对精子冷冻复苏的影响Table 2 Effects of two cryopreservation solutions on sperm cryosurvival at different suspension heights

2.3 不同冻存液稀释比对食蟹猴精子冷冻复苏效率的影响

28份精液样本被用于本实验。使用TTE作为有卵黄冻存液的对照组。在使用不同比例的无卵黄冻存液混合后,冻存液比例越少,平衡后精子活率越高,且稀释比为1∶0.5时复苏率较高。但与TTE相比,冷冻复苏率较低(P＜0.05)。顶体完整率各组之间无差异(见表3)。

表3 3种冻存液在不同稀释比例下对精子冷冻复苏的影响Table 3 Effects of 3 cryopreservation solutions on sperm cryosurvival at different dilution ratios

2.4 精浆对冷冻复苏效率的影响

3份精液样本被用于本实验。设保留和不保留精浆组。使用Quinn’s冻存液,在液氮面悬挂高度为5 cm,稀释比为1∶1的条件下进行精子冻存。在保留精浆的情况下,除了精子平衡后活率差异不显著外,保留精浆组的复苏率及顶体完整率显著高于不保留精浆组(见表4)。

表4 精浆对精子冷冻复苏的影响Table 4 Effect of seminal plasma on sperm cryosuvival

3 讨论

1949年甘油作为冷冻保护剂被成功应用于精子冷冻保存,启动了精液冷冻保存的研究和应用[19]。因卵黄可维持精子膜脂质的稳定性并补充冷冻引起的卵磷脂、胆固醇丢失,故被用于精子的冷冻保存。Origio和Quinn’s为不同品牌精子冷冻保护剂,虽不含卵黄,但其他成分,如葡萄糖,甘油等,也能取得较好的精子冷冻效果,被广泛应用于人类精子库及生殖医学中心。抗冻保护剂主要分为渗透型和非渗透型,而冷冻保护液常包含其中一种或几种成分。不同保护液的冷冻效果也具有差异[20]。例如甘油和乙二醇对猕猴精子保护效果相近,而二甲基亚砜保护效果较差[21]。含有卵黄成分的TTE冻存液有效复苏率波动范围较大,这可能与操作者手法、精子计数经验、食蟹猴精子质量以及不同蛋黄批次有关[6,17,22]。TTE冻存液虽被广泛应用于灵长类精子冻存中,但配制要求较高,需使用当天产出的鸡蛋进行卵黄抽取。除此之外,卵黄成分复杂,且存在生物安全风险,这些因素使得这种冻存液的使用和相关研究具有较大局限性[7]。在本次实验中,共使用3种不同的冷冻保护液,并采用液氮蒸汽法进行精子冷冻。其中TTE冷冻保护剂包含了渗透型的甘油、非渗透型的棉子糖、葡萄糖等物质[23],而商品化人用冻存液除了甘油、糖类等物质外还加入了人血清白蛋白等非渗透型高聚物。此外,Quinn’s冻存液首次被应用于食蟹猴。在参照文献报道及产品说明书操作后,TTE冻存液冻存效率达到了文献报道水平,但另外两种无卵黄商品化冻存液冻存效果较差。因此,本实验采用了不同稀释比例及不同的降温速率对这两种冻存液冻存步骤进行了改良。结果显示,液氮面上悬挂高度为5 cm,稀释比例为1∶0.5时冷冻保护效果最好,且Quinn’s表现出更好的复苏率。

在冷冻过程中,悬挂高度直接影响着细胞内外渗透压和pH的平衡。低高度下的快速降温和高高度下的慢速降温均不适用于食蟹猴的精子冷冻保存,但中高度(5 cm)可有效提高精子的冷冻活率,这可能是由于在距液氮液面较高的高度下,降温过慢导致细胞过度脱水,或者在低高度下冰晶快速形成而造成的细胞死亡。不同的稀释比则决定于精子细胞内脱水速度。实验表明在不同稀释比的条件下,冻存液比例越低,平衡时精子活率相对越高。这可能是随着冻存液用量的减少,降低了冻存液成分如甘油对细胞的毒性作用且降低了细胞渗透压的变化的程度。通过步骤优化发现,最适高度和稀释比均与冻存液说明书不一致。3种冻存液都是以甘油作冷冻保护剂,食蟹猴最适甘油浓度为5%,人的最适浓度为7.5%[24-25]。2种商品化无卵黄冻存液甘油浓度为7.5%,则若采用1∶0.5的稀释比,最终甘油浓度更接近食蟹猴最适甘油浓度,但是否还存在更加适合的降温速率及稀释比还需进一步细化分组。与人的精子冻存效果相比,在复苏率上存在较大差异,除了冷冻保护剂最适浓度不同以外,也可能与精子构成有关。据悉,人精子膜的固醇磷脂比例可达0.88,具有较好的抗冷休克能力,而牛的固醇磷脂比较低,为0.45,且牛精子冷冻复苏效果也较差[23]。因此,这种物种差异引起固醇磷脂比也可能是影响冷冻效率的重要因素之一。为探究精浆对精子冷冻保护作用的影响,本实验比较了保留精浆和去除精浆的精子在冷冻前的平衡活率和经冻存后的复苏率及顶体率。结果显示:在保留精浆后,精子平衡后活率、复苏率及顶体完整率都有提升。这表明精浆对精子的冷冻保护存在一定的益处,且与前人研究一致[22]。在其他动物方面,如猪、羊等保留精浆后冷冻可以增强精子的抗冻能力[26-27]。其作用原理与卵黄类似,含有的脂质和胆固醇可以结合在精子膜上提供保护[28]。与鲜精相比,冻精复苏后的顶体率均存在下降。这表明一部分精子在冷冻后会造成一定程度的顶体损伤。此外,也有一部分精子会自发顶体反应,但由于顶体反应级联信号通路涉及分子较多,机制复杂,如Ca2+、G蛋白等作用,导致本实验中不同条件下顶体完整率暂不具备一定规律[29]。因此,顶体完整率在本实验中可能并不适合被用作评判冻存液效果的有效标准。

本实验仅采用了液氮蒸汽法,改变冷冻方法如定向冷冻、玻璃化冷冻有可能对复苏结果起到一定的改善作用[30-31]。细胞内液渗透压的变化也与平衡时间的长短有关,时间过长引起细胞过度脱水,时间短细胞内残留水分过多,冷冻时会形成更多大冰晶损伤细胞。而平衡温度决定精子是否能提前适应温度的降低。不足的是,本实验未对平衡时间以及平衡温度进行探讨。最新研究报道,利用高压均质这一技术对卵黄进行处理后,使蛋黄中的微生物失去或钝化生物活性,规避了动物源性的污染风险[32-33]。这一技术的改良已成功应用于猪精液的冻存但是否能有效应用于非人灵长类暂不清楚[34]。Wang等[16]将抗冻蛋白III用于猕猴的精子冻存,发现抗冻蛋白的加入对精子冷冻复苏起一定的积极作用,但合适的蛋白浓度也需进一步被确认[35]。

4 结论

本实验成功证实了Origio和Quinn’s这两种冻存液在食蟹猴上的适用性,在优化冷冻步骤后精子复苏后活率显著提升。最佳冻存条件为:冷冻高度距液氮面5 cm、精液冻存液体积比为1∶0.5。与Origio冻存液相比,Quinn’s冻存液具有更好的保护作用。保存精浆可显著提高无卵黄冻存液的冷冻效果。