基于肠道菌群探讨雄性WHBE兔与日本大耳白兔胆固醇代谢的差异性

沈利叶黄俊杰徐剑钦徐雁云陈民利潘永明

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所,杭州 310053)

哺乳动物的胃肠道是由一个动态的、巨大的微生物群落组成,十分复杂,是多基因特征与宿主遗传和环境因素相互作用和共同进化的结果。微生物组学的发展,对揭示肠道微生物群在宿主的生理和免疫中起着重要作用[1]。肠道菌群可调节宿主的许多代谢过程,包括葡萄糖代谢、能量平衡和脂质代谢[2]。肠道菌群的失衡与代谢扰动有关,并可能导致各种疾病致病性,如肥胖和糖尿病[3]。然而,肠道菌群的可遗传性问题或者在多大程度受宿主基因组的影响至今还尚未完全清楚。

在生物医学研究中,兔是常用的实验动物之一,兔在消化、免疫、代谢等领域被广泛的应用。日本大耳白兔黑眼系(white hair and black eyes rabbit,WHBE兔)是从日本大耳白兔(Japanese white rabbit,JW兔)生产群中因发现具有白毛且黑色眼睛的外观表型特征而被保留下来,通过继代培育而成的新的实验兔品系。经过多年的生物学特性研究与应用,发现在免疫代谢、肠易激综合症、神经退行性疾病模型中具有独特的研究价值[4-6],如WHBE兔肠道免疫低于日本大耳白兔[4]。最近本课题组发现雄性WHBE兔总胆固醇水平明显低于日本大耳白兔[7]。近来有研究发现一类携带肠道粪便代谢A(intestinal stool metabolism A,IsmA)基因的特殊肠道菌群,其或能代谢足够的胆固醇来影响宿主的健康[8]。因此,基于肠道菌群与免疫、脂质代谢、保持肠屏障的完整性和调节神经行为特性等多方面的联系[9],深入了解同种不同品系兔胆固醇代谢差异与肠道菌群的联系具有重要的科学意义。本研究以雄性WHBE兔和日本大耳白兔为研究对象,利用16SrRNA微生物测序技术观察这两品系兔肠道菌群结构与功能的变化,进而探讨胆固醇代谢差异与肠道菌群的联系,也为WHBE兔在医学研究中的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

各取4～5月龄普通级雄性WHBE兔和日本大耳白(JW)兔各6只,体重为2.0～2.5 kg;来源于浙江中医药大学动物实验研究中心的繁育基地【SCXK(浙)2020-0005】;饲养于本校动物实验研究中心兔饲养室【SYXK(浙)2021-0012】,12 h/12 h明暗交替,环境温度20～22℃,相对湿度为40%～70%。所有饲养管理与操作经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会批准(IACUC批准号:20190930-06)。

1.1.2 主要试剂与仪器

总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)试剂盒,购自美康生物科技股份有限公司;全自动生化分析仪(3100,日立公司,日本);NovaSeq测序仪(Illumina公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 血脂测定

雄性WHBE兔和JW兔适应性饲养观察均无异常后,禁食不禁水12 h后,取耳中动脉血2 mL,分离血清,在全自动生化仪上测定TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的变化。

1.2.2 结肠内容物的收集和16S rRNA肠道菌群测序

兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠溶液90 mg/kg过量麻醉行安乐死,腹部剃毛并消毒后立即剖腹,用无菌止血钳夹住结肠两端并剪断,转移至无菌操作台下收集结肠内容物。从结肠内容物中提取总DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。用引物341F(5′-CCTACGGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCC-3′)扩增16SrRNA的V3～V4可变区的扩增子。构建16SrRNA测序文库,利用NovaSeq测序仪进行2×250 bp对端测序,对测序得到的原始数据采用cutdapt 1.9软件进行低质量数据过滤,确保后续信息分析结果的准确性。用FLASH 1.2.8软件进行双端拼接,将双端数据合并成一个长的扩增片段,用QIIME2 DADA2插件进行序列质量控制和特征表构建,用QIIME2特征分类器(2019.7)进行序列比对,并用SILVA的物种注释数据库 (release 132)和 NT-16S(2019.04.05)进行注释和后续的生物信息学分析,包括α多样性(Chao1指数、Shannon指数)和β多样性分析。PICRUSt 2.0(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states 2.0)软件和“京都基因和基因组百科全书”(KEGG)数据库用于微生物群落的功能预测。

1.3 统计学分析

所有实验数据用平均值±标准差(±s)表示,统计学处理用GraphPad prism 8.0软件进行,两两比较采用t检验,P＜0.05表示具有统计学意义。用 STAMP (statistical analysis of metagenomic profiles)软件进行Welcht检验,比较门和属水平的相对丰度;肠道菌群菌属的差异分析采用LEFSe(linear discriminant analysis effect size)分析。

2 结果

2.1 两品系兔血脂的变化

雄性WHBE兔血清TC和LDL-C水平均明显低于JW兔(P＜0.05),但两品系兔TG和HDL-C水平则差异不显著(P＞0.05)(见图1)。

图1 雄性WHBE兔和JW兔血脂成分的比较Figure 1 Comparison of blood lipid composition between male WHBE and JW rabbits

2.2 两品系兔肠道菌群多样性分析结果

稀释曲线可用来比较分析不同测序样本中的物种丰富度以及评估测序数据量是否足够。图2A所示,雄性WHBE兔和JW兔的结肠内容物样本的稀释曲线趋向平缓,说明测序深度足够,并发现雄性WHBE兔的物种丰富度低于JW兔。α多样性分析显示,雄性WHBE兔Chao1和Shannon指数均低于JW兔,其中Chao1指数差异显著(P＜0.05);β多样性分析显示,基于主坐标分析(PCoA)中的Bray-Curtis距离指数和ANOSIM统计方法发现雄性WHBE兔和JW兔的群落明显分离,两品系间微生物组分差异显著(Bray-Curtis Anosim R=0.47,P＜0.003),并与非度量多维尺度(NMDS)和Bray-Curtis相似性分析结果一致(stress=0.13,P＜0.003)。聚类树状图分析也显示雄性WHBE兔和JW兔群落区分明显,见图2。

图2 雄性WHBE兔和JW兔肠道菌群多样性分析Figure 2 Diversity analysis of gut microbiota of male WHBE rabbits and JW rabbits

2.3 两品系兔肠道菌群结构与组成分析结果

测序结果显示,雄性WHBE兔和JW兔肠道菌群分别有13个菌门和16个菌门,在WHBE兔中未见梭杆菌门(Fusobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria),其中厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度之和大于90%,是兔肠道菌群中的主要优势菌门。另外,WHBE兔梭杆菌门(Fusobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)和蓝藻菌门(Cyanobacteria)的相对丰度均显著低于JW兔(P＜0.05,P＜0.01),同时厚壁菌门/拟杆菌门比值亦略低于JW兔(P＞0.05)。

属水平上,雄性WHBE兔和JW兔肠道菌群分别发现了198个菌属和253个菌属,其中169个为共有菌属。前15个主要菌属主要包括阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、理研菌科RC9群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、瘤胃球菌科NK4214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、瘤胃球菌属1(Ruminococcus_1)、瘤胃球菌科 UCG_014(Ruminococcaceae_UCG_014)、Firmicutes_unclassified、Clostridiales_vadinBB60 _group_unclassified、Lachnospiraceae_unclassified、Muribaculaceae_unclassified、Ruminococcaceae_unclassified、克里斯滕森菌科 r-7 群(Christensenellaceae_r-7_group)、瘤胃球菌科UCG_013(Ruminococcaceae_UCG_013)、瘤胃球菌科V9D2013群(Ruminococcaceae_V9D2013_group)、Clostridiales_unclassified、梭菌属(Clostridium)。其中WHBE兔Coriobacteriaceae_unclassified、瘤胃球菌科UCG-009(Ruminococcaceae_UCG_009)、厌氧菌属(Anaerovorax)、梭菌属(Clostridium)、DTU014_unclassified、缠结优杆菌群(Eubacterium_nodatum_group)、Defluviitaleaceae_unclassified、Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified、Barnesiellaceae_unclassified、脱卤杆菌属(Dehalobacterium)、理研菌科RC9群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)的相对丰度明显高于JW兔(P＜0.05,P＜0.01),而罗尔斯通氏菌属(Roseburia)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、链球菌属(Streptococcus)、短真杆菌群(Eubacterium_brachy_group)、梭杆菌属(Fusobacterium)、回肠杆菌属(Ileibacterium)、Mollicutes_RF39_unclassified、瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG_014)、瘤胃球菌科1(Ruminococcus_1)、亲铜菌 属(Cupriavidus)、Gastranaerophilales_uncalssified、短波单胞菌属(Brevundimonas)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)的相对丰度均明显低于JW兔(P＜0.05,P＜0.01)(见图3)。

图3 在门和属水平上的雄性WHBE兔和JW兔肠道菌群结构组成的差异Figure 3 Difference of gut microbiota composition between male WHBE and JW rabbits at phylum and genus levels

2.4 两品系兔肠道菌群LEFSe分析

使用LEFSe分析以发现各个层次的显著特征。根据LDA阈值＞3两品系兔间共有15个不同的差异菌属,其中WHBE兔有5种差异菌属,其中Rikenellaceae_RC9_gut_group得分最高;JW兔有10种差异菌属,其中Ruminococcaceae_UCG_014得分最高(见图4)。

图4 LEFSe分析识别潜在的生物标志物Figure 4 Potential biomarkers were defined by LEFSe analysis

2.5 两品系兔肠道菌群功能预测

采用PICRUSt 2.0预测肠道菌群功能,图5结果显示,两品系兔肠道菌群功能差异主要在脂代谢、氨基酸代谢、能量代谢、碳水化合物代谢、有害异物生物降解代谢和膜运输等,其中WHBE兔肠道菌群中氨基苯甲酸降解、细菌分泌系统、光合生物的固碳作用、赖氨酸降解、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、色氨酸代谢等6个途径较丰富,JW兔中花生四烯酸代谢、氰基氨基酸代谢、二恶英降解、醚脂代谢、氟苯甲酸降解、烟酸和烟酰胺代谢、硫铵代谢、二甲苯降解等13个途径较丰富。

图5 PICRUSt 2.0预测两品系兔的肠道菌群功能Figure 5 Prediction of gut microbiota function of two strains of rabbits by PICRUSt 2.0

2.6 肠道菌群及其代谢途径与TC和LDL的相关性分析

Spearson相关分析显示,TC和LDL-C水平与Brevundimonas、Ileibacterium、Fusobacterium、Ralstonia、Mollicutes_RF39_unclassified呈正相关,与Coriobacteriaceae_unclassified、Anaerovorax、Clostridium、DTU014_unclassified、Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified、Barnesiellaceae_unclassified、Ruminococcaceae_UCG-009呈负相关。另外,上述12种差异菌属与花生四烯酸代谢密切相关,同时Mollicutes_RF39_unclassified、Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified、Ralstonia、Brevundimonas、Ruminococcaceae_UCG-009、Clostridium等6个菌属与醚脂代谢亦显著相关,见图6。

图6 肠道菌群及其代谢途径与TC和LDL-C的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of gut microbiota and its metabolic pathways with TC and LDL-C

3 讨论

近来发现,个体之间的微生物群组成也存在较大的不同,并与环境变化和遗传有关[10]。肠道微生物群已被证明影响血液和组织中的脂质代谢和脂质水平,无论是在人类或实验动物上,肠道微生物群的改变与脂质异常引起的相关疾病有关,如动脉粥样硬化、非酒精性肝病[11],故肠道微生物群被认为是宿主代谢的中央调节器。课题组前期在制作WHBE兔胰岛素抵抗动脉粥样硬化模型时,意外发现正常雄性WHBE兔和日本大耳白兔胆固醇水平存在明显差异,并在高脂诱导后WHBE兔胆固醇水平升高更为显著[7],介于脂质与肠道菌群的联系,提示这种现象可能与肠道菌群有关。多样性分析结果也证实了,雄性WHBE兔肠道微生物群的多样性明显低于日本大耳白兔且群落区分明显,表明WHBE兔肠道菌群可能有其自身潜在的特殊性。

与先前关于兔肠道微生物群的研究一致[12],兔肠道微生物群主要以厚壁菌门、疣微菌门和拟杆菌门为主,并发现WHBE兔肠道微生物群在门或属水平上的数量以及厚壁菌门/拟杆菌门比率均小于日本大耳白兔。厚壁菌门/拟杆菌门被认为与宿主微生物发酵产出的能量代谢有关,并通过调节脂肪代谢、炎症以及内分泌功能改变等影响宿主健康状态[13],提示WHBE兔对营养和能量需求可能低于日本大耳白兔。这与LEFSe分析发现与碳水化合物代谢有关的Ruminococcaceae_UCG_014是日本大耳白兔的优势菌属[14],而Rikenellaceae_RC9_gut_group则是WHBE兔优势菌属结果一致,已有报道高丰度的Rikenellaceae_RC9_gut_group与动物每日能量需求降低相关[14];这些变化与肠道菌群功能预测中发现能量代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢途径丰度改变相符。

PICRUSt功能预测发现这两品系兔脂质代谢的差异可能与花生四烯酸代谢和醚脂代谢有关,花生四烯酸代谢可串联营养代谢、免疫力和炎症,在肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病和神经退行性疾病中发挥着重要的作用[15-16],醚脂代谢也与代谢紊乱、神经退行性疾病、癌症有关[17],这两个脂代谢途径也符合当前WHBE兔在医学疾病模型应用中的特殊性。进一步相关分析发现TC和LDL-C水平与Brevundimonas、Ileibacterium、Fusobacterium、Ralstonia、Mollicutes_RF39_unclassified呈正相关,而与Coriobacteriaceae_unclassified、Anaerovorax、Clostridium、DTU014_unclassified、Barnesiellaceae_unclassified、Ruminococcaceae_UCG-009、Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified呈负相关;这些差异菌群也与花生四烯酸代谢或醚脂代谢相关。已有研究表明,Brevundimonas菌可分解和解毒芳香族化合物,与脂质代谢途径呈正相关[18]。Ileibacterium的功能目前虽尚未完全明确,但已有研究发现高脂肪/蔗糖饮食可以使该菌增加10倍[19],提示可能该菌与代谢相关的疾病有关。此外,肠道微生物群对宿主脂质代谢的影响还可能通过肠道微生物群的代谢物所介导的,如短链脂肪酸(SCFA)、次级胆汁酸和三甲胺(TMA)和促炎细菌衍生因子(如脂多糖)。SCFA如乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐均是源自结肠中纤维发酵的细菌代谢物。SCFA对宿主代谢十分重要,可用作能量产生、脂肪生成、糖异生和胆固醇合成的底物[20]。结合文献发现,Ralstonia、Mollicutes_RF39_unclassified、Barnesiellaceae_unclassified、Clostridium、Clostridiales_vadinBB60_group、Coriobacteriaceae_unclassified、Anaerovorax均是产生SCFA的菌群,如Mollicutes_RF39_unclassified通过产生SCFA、诱导T细胞增殖和保护肠粘膜功能进而有益于肠道免疫平衡[21];Clostridiales_vadinBB60_group也能产生SCFA,并与肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗相关[22];Barnesiellaceae能产生丙酸,并与LDL呈负相关[23]。Fusobacterium与TMA分解产物三甲胺N-氧化物(TMAO)明显相关,TMAO被认为与动脉粥样硬化等心血管疾病有关[24]。Rikenellaceae_RC9_gut_group与丁酸代谢和胆汁酸代谢有关[25]。

近来发现,花生四烯酸代谢通路是体内产生炎症介质并诱导炎症的主要通路,其代谢通路包括环氧合酶(COX)脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450(CYP450)3种途径。肠道菌群中拟杆菌门下的一些菌群可自身产生花生四烯酸代谢产物,同时,肠道菌群的结构与功能发生改变也可以通过蛋白激酶C途径激活磷脂酶A2,使花生四烯酸从膜磷脂中释放出来,进而通过花生四烯酸的三条代谢通路被分解为各种促炎类花生酸[26],这一途径也会使生物膜发生代谢,胆固醇作为生物膜的重要组成成分,从而影响胆固醇代谢。有研究发现,饲喂花生四烯酸能使小鼠肠道菌群中的Clostridium、Ruminococcaceae_UCG-009等与肥胖相关的菌群发生改变,菌群的改变与花生四烯酸相互作用,可能影响体内相关的脂代谢[27];且这些菌群以及厚壁菌门和拟杆菌门比值均在WHBE兔和JW兔中存在差异。此外,醚脂是甘油磷脂中独特的一类,不仅是哺乳动物细胞膜的结构组分和第二信使贮存器,而且还可能参与膜融合、离子运输、胆固醇流出和氧化,同时醚脂也影响生物膜中脂筏结构域的组织和稳定性[28]。Clostridium菌属中存在醚脂已经有不同的研究报道[28],在其他益生菌中也推测存在醚脂,肠道菌群与醚脂代谢途径可能存在紧密联系。因此,推测雄性WHBE兔的肠道菌群结构与功能的差异影响花生四烯酸代谢和醚脂代谢,进而影响胆固醇代谢的变化。

综上所述,雄性WHBE兔和JW兔胆固醇代谢的差异性与宿主的肠道菌群结构与功能差异有关,其中肠道菌群中的花生四烯酸代谢和醚脂代谢途径尤为关键。