胰岛素对人心肌细胞QT间期及诱发心律失常的影响

谢学刚，魏 峰，2，3，张玉顺，王星烨，霍建华，王亭忠，马爱群

（1.西安交通大学第一附属医院结构性心脏病科，陕西西安 710061；2.环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061；3.陕西省分子心脏病学重点实验室，陕西西安 710061；4.西安交通大学第一附属医院心血管内科，陕西西安 710061）

长QT综合征（long QT syndrome,LQTs）是一种心电图表现为QT间期延长、易发生如尖端扭转型室性心动过速（Torsades de Pointes,TdP）等恶性室性心律失常而导致晕厥及心源性猝死的心脏离子通道病[1]。在某些病理状态（如心肌病、心肌缺血、心肌炎等）、药物（如抗心律失常药物、抗生素、抗肿瘤药、精神类药等）、环境（如电解质紊乱、有机磷中毒、酗酒等）等影响下，可诱发QT间期延长并继发Td P等恶性心律失常，造成严重的不良后果。

目前临床上仍缺乏可直接显著缩短QT间期的LQTs治疗药物，筛选或开发能够直接缩短QT间期的小分子化合物或药物一直是该领域的研究热点。本研究组同期在筛选小分子化合物抗心律失常的研究中发现：胰岛素可显著缩短人诱导多潜能干细胞来源的心肌细胞（human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs）的阈电位时程（field potential duration,FPD，类似心电图的QT间期）及FPDc（类似心电图的QTc），并且显著降低hERG通道阻滞剂E4031所诱发的心律失常风险。本研究可为阐明胰岛素对人心肌细胞电生理特性的影响及其改善相关因素所致的QT间期延长与心律失常发生风险提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Maestro微电极矩阵（microelectrode array,MEA）记录系统、MEA细胞培养板购自美国Axion Biosystems，IXplore型荧光倒置显微镜购于日本Olympus，CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman Coulter。Fibronectin购自美国Roche Life Science，E4031和DMSO（dimethyl sulfoxide）购自美国Millipore Sigma。hiPSC-CMs、Plating细胞培养基和Maintenance细胞培养基均购自美国CDI（Fujifilm Cellular Dynamics International），cTnT抗体购自英国Abcam。

1.2 hiPSC-CMs的培养与接种

hiPSC-CMs来自于CDI的iCell Cardiomyocytes2细胞株，为健康个体来源，细胞培养按照CDI推荐的方法进行：接种前，使用Fibronectin（50μg/mL）预处理MEA培养板，37℃、50 mL/L CO2培养箱中孵育培养板1 h备用。复苏细胞，37℃水浴3 min后将1 mL的细胞悬液从冻存管转移至50 mL离心管中，并用1 mL Plating细胞培养基冲洗冻存管后逐滴滴入离心管中，再另吸取3 mL Plating培养基逐滴滴入50 mL离心管中，计数细胞。1 250 r/min离心5 min，调整细胞密度至1×107/mL，于Fibronectin预处理的48孔MEA培养板中每孔滴种5μL细胞悬液（需滴种在每孔电极交叉的中央位置），于培养箱中孵育3 h，每孔加入300μL的Maintenance细胞培养基，每48 h换液，1周后行药物干预处理。

1.3 hiPSC-CM s细胞纯度的评价

采用流式细胞术分析心肌标志物cTnT在hiPSCCMs中的表达进行细胞评价。hiPSC-CMs复苏后按4×106/孔的细胞密度接种于10μg/mL Fibronectin处理过的6孔板中，培养1周至细胞达90%汇合后，PBS清洗2次，胰酶消化3～5 min，1 250 r/min离心5 min，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗，2 mL/L的TritonX-100处理15 min，PBS冲洗，按照1∶100比例稀释加入1μL cTnT一抗，室温孵育2 h；PBS冲洗，按照1∶500比例稀释加入1μL荧光二抗FITC，室温孵育2 h，PBS冲洗，重悬细胞后于流式细胞仪上分析。

1.4 免疫荧光检测cTn T在hiPSC-CMs中的表达

hiPSC-CMs复苏后种植于经50μg/mL Fibronectin预处理的18 mm×18 mm盖玻片上，培养1周后，40 g/L多聚甲醛固定，2 mL/L Triton-X 100穿膜15 min，50 g/L牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min。一抗cTnT按照1∶100稀释后加入，于4℃过夜孵育。PBS冲洗后，荧光二抗FITC按照1∶500稀释后加入，室温孵育1 h，DAPI复染，封片，荧光显微镜观察。

1.5 MEA检测hiPSC-CMs的电活动

hiPSC-CMs培养2 d，可行MEA实时检测细胞电活动；培养6 d，hiPSC-CMs电生理参数趋于稳定；培养7 d，hiPSC-CMs分为两组（未干预组：正常培养基，即NM组或对照组；干预组：正常培养基+胰岛素干预，即NM+INS组），分别检测其电活动。检测过程：打开软件，打开控制Maestro电极接触槽（底部可加热且槽内通入50 mL/L CO2）的温度和CO2控件，待温度稳定在37℃，CO2稳定在50 mL/L时，将细胞培养板放入Maestro电极接触槽内，稳定平衡10 min，记录整个培养板所有孔及孔中每个电极检测到的细胞电活动，每次记录3 min。将记录的文件导入到数据分析软件CiPA Analysis中，手动确定每孔记录到电波的T波顶点位置以确定FPD，同时分析判定有无心律失常以及心律失常类型[2]（包括A、B、C、D共4种类型），软件再依据T波顶点位置可自动计算出FPD值、心跳间期（beat period，BP，相当于心电图的R-R间期）、锋电位（spike amplitude）、传导速率（conduction velocity,CV）；并进而根据BP计算出心率（heart rate，HR，即HR=60/BP），根据FPD及BP计算出FPDc（FPDc=FPD/BP1/3）。

1.6 药物干预hiPSC-CMs及实验分组

在评价hiPSC-CMs对快速激活延迟整流钾电流（IKr）阻滞剂E4031的反应实验中，正常培养基（NM）培养的hiPSC-CMs分为3组，分别给予1、10、100 nmol/L的E4031进行干预。

在探讨胰岛素对E4031诱发hiPSC-CMs的FPD延长及心律失常影响的实验中，hiPSC-CMs分为胰岛素干预组（NM+10 mg/L胰岛素干预，即NM+INS组）和未干预组（NM培养，即NM组）；分别处理5 d后，NM+INS和NM组分别再分为5组，分别给予DMSO、各浓度E4031（3、10、30、100 nmol/L）的干预。

药物E4031干预两组（NM+INS组与NM组）hiPSC-CMs时，干预前16 h，两组细胞培养液完全更换为各自新鲜培养基（NM+INS与NM）270μL，按照MEA检测流程记录基线的MEA数据，每孔加入30μL E4031（浓度为最终工作浓度的10倍）干预，每10 min记录1次MEA数据，每次记录3 min，共记录1 h，分析加入药物后30 min的数据以评价药物的作用。

1.7 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料用（±s）表示，hiPSC-CMs培养过程中各电生理参数变化的比较采用Dunnett-t检验，比较其他不同时间点与培养6 d时参数的差异；E4031干预hiPSC-CMs后FPD及FPDc变化的组间比较采用配对t检验，两组心律失常发生的孔数比较采用Fisher确切概率法；胰岛素干预hiPSC-CMs前后各电生理参数的组间比较采用两因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。心律失常的分析经过软件自动分析与人工再次分析确认，若一组中≥3/5个孔出现心律失常，则不再分析FPD及FPDc（心律失常影响FPD分析的准确性），只标注并比较心律失常发生的孔数。

2 结 果

2.1 hiPSC-CMs的形态学特征及纯度分析

hiPSC-CMs接种培养48 h，镜下观察即可见局部hiPSC-CMs不规律的收缩活动，培养96 h可观察到多处hiPSC-CMs规律的收缩活动，培养6～7 d，可见hiPSC-CMs连接成片、大范围的统一规律的收缩活动，此时hiPSC-CMs多呈类圆形、椭圆形或类短杆状，细胞体积大，单核或双核，核多居中，胞质体积较大，胞质内可见整齐排列的肌节结构，细胞高表达心肌标志物肌钙蛋白T，细胞间相互连接，呈均匀分布，无序排列（图1A）。经流式细胞术分析显示，97.06%的hiPSC-CMs表达心肌肌钙蛋白T（图1B）。

图1 培养hiPSC-CMs的形态学特征及纯度分析Fig.1 Morphological characteristics and purification of hiPSC-CMs

2.2 hiPSC-CMs的电生理特征

hiPSC-CMs复苏后接种于48孔MEA细胞培养板中，培养2 d即可检测到部分孔中不规则的电活动，培养4 d可检测到大部分孔中较规则的电活动，培养6 d可检测到全部孔中规则的电活动。电生理参数分析显示，随着培养时间的延长，FPD从2 d时299 ms延长至10 d时的474 ms，培养6 d时的FPD与8 d、10 d（449、468、474 ms）时无明显差异（图2A、图2B）；随着培养时间的延长，hiPSC-CMs的HR逐渐减慢，从2 d时55次/min（beat per minute,bpm）降低至10 d时的33 bpm，培养8 d、10 d时的HR与6 d时无明显差异（图2C）；FPDc也随着培养时间的延长而延长，从2 d时291 ms延长至10 d时的390 ms，培养6、8、10 d时FPDc（381、387、390 ms）无明显差异（图2D）；锋电位也随着培养时间的延长而增加，从2 d时0.79 mV增加至10 d时的3.73 mV，培养6、8、10 d时锋电位（3.8、3.6、3.73 mV）无明显差异（图2E）；培养过程中传导速率无明显变化，CV波动于0.22～0.24 mm/ms（图2F）。

图2 培养hiPSC-CMs的电生理特征Fig.2 Electrophysiological characteristics of hiPSC-CMs

2.3 hiPSC-CMs对I Kr阻滞剂的反应

为了进一步评价hiPSC-CMs的电生理功能，使用IKr阻滞剂E4031干预hiPSC-CMs。结果显示，1 nmol/L的E4031对hiPSC-CMs的FPD及FPDc无明显影响（P＞0.05）；10 nmol/L的E4031可明显延长hiPSC-CMs的FPD（ms）（440.0±21.7vs.635.2±38.6，P＜0.001）及FPDc（ms）（380.4±12.8vs.528.8±27.5，P＜0.001）；100 nmol/L的E4031则诱发hiPSCCMs发生严重心律失常（图3）。可见，hiPSC-CMs对IKr阻滞剂的反应与临床结果一致，且此效应呈剂量依赖性。

图3 I Kr阻滞剂E4031干预培养hiPSC-CMs时FPD（A）和FPDc（B）的变化Fig.3 Changes of FPD and FPDc of hiPSC-CMs with treatment of I Kr blocker E4031

2.4 胰岛素对hiPSC-CMs电生理特征的影响

hiPSC-CMs经10 mg/L胰岛素处理5 d，处理与未处理组的HR较5 d前均减慢，处理组HR从处理前的（32.8±0.6）bpm降低至处理后的（27.4±1.6）bpm，而未处理组从5 d前的（32.2±0.8）bpm降低至（23.1±0.9）bpm，但处理组相对未处理组HR增快（11.9±3.3）%（图4A）；经胰岛素处理后，处理组FPD在处理前后无明显变化[（470.4±6.4vs.470.0±19.6）ms]，未 处 理 组 从（471.6±24.7）ms延 长 至（578.6±47.4）ms，处理组相对未处理组FPD缩短（22.7±2.8）%（图4B）；胰岛素处理后，处理组FPDc处理前后缩短[（384.8±4.0vs.361.9±9.7）ms]，未处理组延长[（383.4±21.2vs.420.8±34.8）ms]，处理组相对未处理组FPDc缩短（15.6±1.6）%（图4C）；胰岛素处理后，处理组与未处理组锋电位均较处理前增加[（2.6±0.3vs.4.2±0.4）mV、（2.4±0.6vs.3.0±0.4）mV],处理组较未处理组增加了（39.1±7.9）%（图4D）；胰岛素处理后，处理组与未处理组hiPSC-CMs在处理前后的CV无明显变化（图4E）。

经胰岛素处理后的hiPSC-CMs再给予IKr阻滞剂E4031干预，结果发现胰岛素显著缩短了E4031诱发hiPSC-CMs的FPDc延长，并降低了其诱发的心律失常风险。3 nmol/L的E4031使对照组（NM组）的FPDc延长（20.3±5.4）%，而胰岛素处理组（NM+INS组）的FPDc延长（12.2±1.5）%，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；10 nmol/L的E4031使对照组FPDc延长（37.8±9.0）%，而胰岛素处理组的FPDc延长（21.8±3.1）%，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）；30 nmol/L的E4031使对照组hiPSC-CMs的FPDc延长（95.9±10.6）%，且2个孔诱发出了心律失常，而胰岛素处理组FPDc延长（40.8±4.9）%，各孔均未诱发出心律失常，两组间差异存在统计学意义（P＜0.001）；100 nmol/L的E4031干预后，对照组各孔均诱发出了严重的心律失常，但胰岛素处理组仅2个孔诱发出心律失常，其FPDc延长（59.6±6.2）%，两组间差异存在统计学意义（P＜0.001）。同时，E4031诱发两组FPDc延长及心律失常的发生均呈现出药物的剂量效应关系（图4F）。

图4 胰岛素对培养hiPSC-CM s电生理特性的影响Fig.4 Impact of insulin on electrophysiology of hiPSC-CMs

3 讨 论

目前临床上缺乏可直接显著缩短心肌QT间期而治疗LQTs的药物。研究发现，Flurandrenolide可缩短斑马鱼I59S突变（蛋白运输障碍）LQT 2模型的动作电位时程[3]；HUO等[4]在以HEK293细胞为模型的研究中发现，NS1643可增加G604S突变（蛋白折叠运输障碍）的Ikr电流表达，可能对LQT 2治疗有效。但这些研究结果未能在人心肌细胞中得到验证，且既往研究LQTs突变基因表达所用的异质表达系统（HEK293细胞或爪蟾卵母细胞）和遗传动物模型不能完全代表存在明显差别而又具有复杂电生理特征的人心肌细胞[5]。随着人诱导多潜能干细胞来源的心肌细胞技术的成熟，hiPSC-CMs已成为体外研究遗传性心脏疾病[6-9]（LQTs、Brugada综合征、肥厚型心肌病、左室致密化不全心肌病等）及进行药物筛选的新平台[2,10]，该模型已体现出促进临床直接转化的特点与优势。

本研究以hiPSC-CMs为模型发现，胰岛素可以显著缩短hiPSC-CMs的FPD（类似心电图QT间期）及FPDc（类似心电图QTc），并且显著降低hERG通道阻滞剂E4031所诱发的FPD延长及心律失常风险，提示临床上已安全应用的胰岛素可以直接缩短心肌QT间期而可能发挥治疗LQTs的作用。同时相关临床研究也发现66.7%的1型糖尿病和51.3%的2型糖尿病患者心电图QTc明显延长[11]，而合并糖尿病的急性心肌梗死患者输注胰岛素治疗24 h后，可改善QTc延长[12]。也有基础研究发现胰岛素可有效缩短糖尿病兔心肌细胞模型延长的动作电位时程[13]。这些也提示胰岛素具有缩短心肌QTc的作用，这与本研究结果相一致。这些发现为胰岛素治疗获得性或遗传性LQTs奠定了理论与实验基础。但胰岛素同时可降低血糖，临床应用存在致低血糖风险。因此，进一步对胰岛素缩短hiPSC-CMs的QT间期及降低心律失常风险的作用机制与通路进行深入研究，将为发现新的靶点及针对新靶点而筛选或开发新药用以治疗LQTs奠定基础，这将避免应用胰岛素时对血糖的影响。

本研究发现在胰岛素干预hiPSC-CMs的5 d时，对照组（未干预组）的FPD及FPDc延长，HR显著减慢，锋电位与CV无显著变化。而胰岛素干预组HR也较前减慢，FPD及FPDc干预前后无明显变化，但相对对照组却明显缩短，锋电位于干预后明显增加。这提示，随着hiPSC-CMs培养时间的延长，hiPSC-CMs本身存在心率逐渐减慢，FPD及FPDc逐渐延长的电生理过程，这可能是细胞逐渐趋于成熟的一种电生理改变。LUNDY等[14]研究也发现，随着培养时间的延长，hiPSC-CMs心率逐渐减慢，APD90也逐渐延长，当培养至80～120 d时，HR减慢至（9.3±3.1）bpm，APD90延长至（188.9±35.8）ms；同时细胞体积、肌纤维大小与排列、肌节等结构明显趋于成熟。其他研究也提示长时间培养有利于hiPSC-CMs结构与功能的成熟[15-16]。

本研究发现，hiPSC-CMs在培养过程中，HR随着时间的延长而逐渐减慢，FPD及FPDc逐渐延长，锋电位逐渐增加，CV无明显变化；而这些电生理参数的变化基本在6～10 d达到稳态，提示此时可能是药物干预的最佳时机。因此，本研究在hiPSC-CMs培养7 d时给予胰岛素及其他药物干预。同时，本研究为了降低HR对FPD的影响，采用经HR校正的FPDc，且本研究中FPDc采用其他研究普遍采用的FPDc=FPD/BP1/3公式计算，而非类似于临床QTc计算的FPDc=FPD/BP1/2，主要考虑到hiPSC-CMs自身基础心率较慢（约30～50 bpm），采用FPDc=FPD/BP1/2校正将带来较大偏差。同时也可采用起搏模式使各培养孔中的hiPSC-CMs按同一频率起搏，以去除HR对FPD的影响，且最新研究也证实了电刺激可有效地降低hiPSC-CMs对离子通道阻滞剂反应的变异性[17]。

本研究在筛选小分子化合物抗心律失常的基础上，明确提出胰岛素可显著缩短hiPSC-CMs的FPD/FPDc，并显著降低hERG通道阻滞剂所诱发的FPD/FPDc延长及心律失常风险，为胰岛素治疗获得性或遗传性LQTs奠定了部分理论与实验基础。后续进一步的机制研究将为阐明胰岛素缩短QT间期而发挥抗心律失常作用的分子通路机制奠定基础。