基于网络药理学和分子对接技术探讨补肾健脾方治疗卵巢早衰的机制

朱景茹，黄睿婷，林泽豪，王 洋

（福建中医药大学中医证基地，福建 福州 350122）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）好发于40 岁之前的育龄期女性，是以高卵泡刺激素和低雌激素水平为主要特征的卵巢功能衰退性妇科疾病［1］。据流行病学统计，POF 在一般人群中的发病率为1%～3%，在原发闭经的患者中发病率高达10%～28%，在继发闭经的患者中发病率达4%～18%［2］，是导致女性不孕的重要原因之一。目前现代医学以周期性激素疗法为常用治法，但长时间激素治疗容易诱发不良反应，增加POF 患者发生乳腺癌、子宫内膜癌的风险［3］。中医学认为卵巢中蕴含生殖之“精”，依时排泄以供生殖之需，泄出真元后，卵巢表面形成黄体以维持子宫内膜生长，使之易于容受胚胎着床［4］。有研究认为补肾健脾类中药对POF 患者各级卵泡的生长均有促进作用，能够改善卵巢发育状态，促进卵泡颗粒细胞的增殖［5-6］。中药复方成分的药效学及其作用机制的研究是中药现代化的关键科学问题，网络药理学为中药化合物作用机理的研究提供新的理论方法和研究思路［7］。本研究基于网络药理学和分子对接技术探讨补肾健脾方与POF 作用靶点之间的网络关系，为补肾健脾方治疗POF 的作用机制提供一定依据。

1 方 法

1.1 补肾健脾方活性成分筛选 通过中药系统药理学系统与数据分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］检索补肾健脾方中熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、茯苓、人参、白术、甘草的所有活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为筛选条件进行药物靶点过滤、获取。

1.2 POF 治疗靶点的获取 以“premature ovarian failure”作为检索词在GeneCards 数据库（http：//www.genecards.org/）［9］检索相关疾病靶点，以相关性得分≥20 进行提取。通过Uniport 数据库（http：//www.uniprot.org）进行标准化处理，通过InteractiVenn网站（http：//www.interactivenn.net/）获得韦恩图，将POF 治疗靶点与补肾健脾方的作用靶点进行映射，获取补肾健脾方治疗POF 的共同靶点，绘制补肾健脾方活性成分-靶点网络图。

1.3 共同作用靶点互作网络（PPI 网络）构建与分析 将共同靶点输至String 数据库（http：//stringdb.org/）“multiple proteins”检索框中，物种设置为“homo sapiens”，输出初始PPI tsv 文件，再使用Cytoscape 3.8.0 软件构建PPI 网络，以最低交互分数≥0.90 为标准筛选出排名前20 名的核心靶点。

1.4 GO和KEGG富集分析 将共同靶点导入DAVID数据库（http：//david.ncifcrf.gov/）进行分析，在R 语言中安装“DOSE”“colorspace”“stringi”“pathview”“clusterProfiler”插件，以P＜0.05 为阈值进行GO 和KEGG富集分析，筛选出前20 名的生物学过程与信号通路。

1.5 分子对接 利用PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到补肾健脾方活性成分的结构信息，在PDB 数据库中检索核心靶点的结构，最后利用Vina1.1.2 软件完成补肾健脾方活性成分与前5 位核心靶点的分子对接。

2 结 果

2.1 补肾健脾方活性成分信息 共筛选出补肾健脾方活性成分159 个，列出单味中药OB 值排名前2位的活性成分信息，见表1。

表1 补肾健脾方活性成分信息

2.2 补肾健脾方活性成分-靶点网络 共筛选出补肾健脾方作用靶点235 个，将其与347 个POF 治疗靶点取交集得到62 个共同靶点，从而获得补肾健脾方活性成分-靶点网络。见图1。

图1 补肾健脾方活性成分-靶点网络图

2.3 PPI 网络分析结果 PPI 网络中共有62 个节点，435 条边，见图2。根据Degree 值对节点进行排序，结果中仅列出排名前20 名的核心靶点，分别为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白细胞介素-6（IL-6）、表皮细胞生长因子（EGF）、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、原癌基因（MYC）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受体1（ESR1）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、环加氧酶2（PTGS2）、低聚果糖（FOS）、酪氨酸激酶受体2（ERBB2）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、趋化因子2（CCL2）、白细胞介素-1β（IL-1β）、丝氨酸蛋白酶抑制剂1（SERPINE1）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（MTOR）。见图3。

图2 PPI 网络图

图3 排名前20 的核心靶点图

2.4 GO 和KEGG 富集分析 共获取GO 条目87个，结果表明补肾健脾方治疗POF 的前20 个生物学过程主要富集于DNA 结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、磷酸酶结合、细胞因子受体结合、核受体活性、配体激活转录因子活性、类固醇激素受体、泛素蛋白连接酶结合、生长因子受体结合等，见图4。KEGG 富集分析筛选到129 条信号通路（P＜0.05），前20 条信号通路主要涉及到癌症中蛋白多糖相关通路、人类巨细胞病毒感染相关通路、HIF-1 信号通路、内分泌抵抗相关通路、AGERAGE 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信 号 通 路等。见表2。

表2 KEGG 富集分析信号通路

2.5 分子对接结果 为了进一步验证补肾健脾方活性成分-靶点网络的预测结果，将2.3 中排名前5 位的核心靶点AKT1、VEGFA、CASP3、IL-6、EGF与其对应的活性成分进行分子对接，获得活性成分与核心靶点分子对接自由能，见表3。自由能＜0 kcal/mol 说明配体与受体可以自发结合，一般认为两者结合自由能越低，发生作用的可能性越大。补肾健脾方活性成分与核心靶点结合自由能均＜-5 kcal/mol，提示筛选出的核心靶点与其对应的活性成分具有良好的亲和力。其中，薯蓣皂苷元与AKT1、VEGFA、CASP3、IL-6、EGF 结合自由能最低，亲和力最高，分子对接模式见图5。

图5 薯蓣皂苷元分子对接模式图

表3 活性成分与核心靶点分子对接自由能

3 讨 论

卵巢早衰归属中医学中“经水早断”“不孕”等范畴，中医认为肾精盈满，天癸成熟，寓示着女性生殖活动的开始。若肾精衰减，天癸耗竭，月经迟闭，则意味着卵巢生殖功能的终结［10］。肾中先天之精与脾胃后天之精皆为卵巢卵泡发育过程中关键的物质基础，是女性生殖与发育的根本。若脾肾亏虚，冲任失调，天癸耗竭，则卵巢卵泡无以为养，经水渐断。补肾健脾方是左归饮（《景岳全书》）与四君子汤（《太平惠民和剂局方》）的合方，由熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、人参、茯苓、白术、甘草8 味药组成，具有补肾健脾、益气滋阴的功效。

本研究采用网络药理学分析补肾健脾方活性成分的复杂性和人体潜在调控靶点的多样性，结果显示：补肾健脾方的主要活性成分有薯蓣皂甙元、β-谷甾醇、槲皮素、柚皮素、山柰酚等。张永忠等［11］研究表明：薯蓣皂苷元能抑制A547 细胞的生长，诱导细胞凋亡，还有抗炎、抑菌、平喘、降血脂等作用；β-谷甾醇具有广泛的药理活性，如免疫调节、抗炎、抗氧化、抑制肿瘤等［12］；槲皮素是黄酮类化合物，可以发挥抗炎、抗氧化、抗菌等作用，有效促进颗粒细胞增殖和各级卵泡发育，增加雌激素分泌，从而改善POF 大鼠的卵巢功能［13-14］；柚皮素是从芸香科植物柚中提取的一种单体成分，属于黄酮类化合物，具有较强的清除自由基、抗氧化、抗炎作用［15］；山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、心脏保护、神经保护、抗糖尿病、抗骨质疏松、抗雌激素、抗焦虑、镇痛和抗过敏等活性［16］。

选取前5 个核心靶点AKT1、VEGFA、CASP3、IL6、EGF 与活性成分山柰酚、柚皮素、槲皮素、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇进行分子对接验证，结果显示核心靶点与活性成分结合活性良好，以薯蓣皂苷元与各蛋白的分子对接结果最好。本研究GO 富集分析结果显示：补肾健脾方作用于POF 的机制涉及多个生物过程与分子功能，其中相关性最高的生物学过程涉及DNA 结合转录激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、磷酸酶结合、细胞因子受体结合、核受体活性等。KEGG 富集分析结果显示：补肾健脾方治疗POF 的作用机制与癌症中蛋白多糖相关通路、人类巨细胞病毒感染相关通路、HIF-1 信号通路、内分泌抵抗相关通路、AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 等密切相关。可以看出，POF 的发生可能与肿瘤的发生有关，与巨细胞病毒感染、缺氧炎症反应也可能密切相关。缺氧是能量代谢、细胞增殖和死亡过程中发生的一种生理应激，在卵泡发育过程中，由于基底屏障阻隔了血管向卵泡内部的渗透，卵泡内形成局部低氧环境［17］，HIF-1 信号通路是生物处于低氧状态下的应激信号通路，可通过调节HIF-1α 功能来保护卵巢功能。TNF-α 与POF 发生有关，炎症和相关的氧化应激反应还能通过过早激活原始卵泡使之耗竭，影响正常生殖年龄女性的生育能力［18］。IL-17 水平升高可直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子和抗微生物蛋白识别介导自身免疫和慢性炎症反应［19］，炎症反应增强可促进卵巢功能衰竭，从而参与POF 的发生。

综上所述，我们采用网络药理学方法初步预测了补肾健脾方治疗POF 的作用机制，其可能是通过槲皮素、β-谷甾醇等主要活性成分起到抗炎、抗氧化、免疫调节的作用，降低炎性因子IL-17 水平来减轻POF 卵巢细胞的缺氧状态，调节HIF-1α 等细胞转录因子和蛋白的表达，或通过调控TNF 等信号通路，从而改善卵泡的发育状态，起到治疗POF的作用，具有一定的研究价值。为进一步验证网络药理学结果的可靠性，后期有必要开展相应的基础实验进一步阐释补肾健脾方治疗POF 的作用机制。