大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4致小鼠急性肝损伤的作用

陈 婷，陈亚萍，许晓丽，曹亚俊，南丽红

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

急性肝损伤是诱发肝硬化、肝癌的重要使动因素，具有病因多、发病急的特点，若疾病没有得到及时治疗会逐渐加重，发展为具有高致死率的急性肝衰竭［1］。炎症反应在肝损伤发生、发展中发挥重要作用，而核转录因子kappa B（NF-κB）是细胞内炎症信号传递最重要的核转录因子，在肝损伤发生发展中，NF-κB 被磷酸化后激活，暴露出核定位信号，从而启动下游肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等炎症因子转录表达，此外，NF-κB 还能调控内皮细胞表达趋化蛋白-1（MCP-1）以及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）［2-3］，从而增加炎症介质释放，放大炎性反应，进一步诱发或加重肝损伤。现代药理学研究表明：大黄具有较好的保肝作用［4］，其中大黄主要活性成分大黄素甲醚和芦荟大黄素均可发挥对急性肝损伤的保护作用［5-6］，但大黄素甲醚为多羟基的蒽醌类物质，口服后血药浓度较低，而以大黄素甲醚为苷元的大黄素甲醚-8-Oβ-D-葡萄糖苷（PMG）是含蒽醌结构的糖苷类化合物，口服后血药浓度相对较高［7-8］，但其对急性肝损伤是否具有保肝作用未见相关报道，故本实验通过复制CCl4致小鼠急性肝损伤模型，探讨PMG 的保肝作用及可能机制，为进一步开发应用中药大黄提供一定的科学依据。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF 级雄性ICR 小鼠60 只，体质量（18±2）g，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司，许可证号为：SCXK（沪）2017-0005，在福建中医药大学实验动物中心SPF 级饲养室饲养1 周，合格证号为：SYXK（闽）2019-0007。

1.2 药物与试剂 PMG 粉末（成都普思生物科技股份有限公司，CAS 号：26296-54-8，纯度≥98%）；联苯双酯滴丸（北京协和药厂，批号：201201）；四氯化碳（CCl4，罗恩试剂，批号：RH280952）；二甲基亚砜（DMSO，货号：67-68-5）、CMC-Na（货号：9004-32-4）均购自北京索莱宝科技有限公司；花生油溶液（品牌：胡姬花，批号：20210409）；谷丙转氨酶试剂盒（ALT，货号：C009-2-1）、谷草转氨酶试剂盒（AST，货号：C0010-2-1）均购自南京建成生物工程研究所；TNF-α 一抗（货号：CPA2174）、IL-6 一抗（货号：CPA4914）均购自英国Cohesion Biosciences公司；NF-κBp65 一抗（美国CST 公司，货号：8242）；免疫组化试剂盒（货号：SA1020）、DAB 显色试剂盒（货号：AR1027-3）均购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol 试剂（货号：R401-01）、ChamQ SYBR qPCR Master Mix 试剂盒（货号：Q311-02）、QRT Su-perMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒（货号：R123-01）均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；所用引物均由Sangon Biotech 公司根据设计合成。

1.3 主要仪器 BSA223S-CW 型分析天平（德国Sartorius 公司）；7900 HT 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；Infinite 200PRO 多功能酶标仪（瑞士TECAN 公司）；DMi8 荧光倒置显微镜（德国Leica 公司）；FastPrep-24 5G 匀浆机（美国MP 公司）；HM 325石蜡切片机（美国Thermo Fisher 公司）；Centrifuge 5418 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）。

2 方 法

2.1 实验方法

2.1.1 药物制备 精密称取200 mg PMG 粉末溶于0.25 mL DMSO，震荡混匀后加入0.5% CMC-Na 溶液将其配置成高剂量4 mg/mL PMG 混悬液，取部分高剂量PMG 混悬液按1∶1 分步稀释为2 mg/mL及1 mg/mL PMG 混悬液。取660 mg 联苯双酯滴丸于研钵中磨成粉末，加入0.5%CMC-Na 溶液将其配制成30 mg/mL 联苯双酯混悬液。取0.1 mL CCl4分析纯溶液，加入花生油溶液配制成0.5%CCl4油溶液。

2.1.2 分组与给药 将60 只小鼠按随机数字表法分为正常对照组，模型组，低、中、高剂量组，联苯双酯组，每组10 只。每组小鼠每次均按照0.1 mL/10 g体质量灌胃给药，正常对照组和模型组灌服0.5%CMC-Na溶液，低、中、高剂量组分别灌胃1、2、4 mg/mL PMG 混悬液，联苯双酯组灌胃30 mg/mL 联苯双酯混悬液。2 次/d，连续灌胃3 d。

2.1.3 急性肝损伤模型的制备 末次给药1 h 后，除正常对照组外，其余各组均按照0.1 mL/10 g 体质量一次性腹腔注射0.5% CCl4油溶液，建立急性肝损伤小鼠模型。血清ALT、AST 水平明显高于正常对照组则提示模型成功［9］。

2.1.4 取材 各组小鼠禁食不禁水16 h，摘眼球取血后处死，并分离肝组织，用预冷的生理盐水清洗肝脏表面后，再用滤纸吸干表面液体并拍照留存。取肝左叶置于4%多聚甲醛中于4℃冰箱中固定48 h；另取肝右叶冻存于液氮中，后转至-80℃冰箱保存。

2.2 观察指标

2.2.1 肝功能指标检测 将血液于高速冷冻离心机（4000 r/min、4℃）中离心10 min，取上清液，根据转氨酶试剂盒说明书检测小鼠血清ALT、AST 水平。

2.2.2 肝组织病理形态学观察 将固定好的肝左叶组织采用梯度脱水后，石蜡包埋，切成4 μm 薄片，进行HE 染色，封片后通过倒置荧光显微镜200倍镜下观察组织病理形态并摄片。

2.2.3 免疫组织化学法检测肝组织中NF-κBp65、TNF-α、IL-6 蛋白表达 每组随机选取6 只小鼠肝左叶的石蜡切片，常规脱蜡至水，滴加内源性过氧化物酶阻断液，室温反应45 min；采用微波辐射法修复抗原，滴加5%BSA，室温封闭1 h；除去封闭液，滴加相应一抗（NF-κBp65 稀释比为1∶400，TNF-α、IL-6 稀释比均为1∶50），4℃孵育过夜；滴加二抗和SABC，各孵育1 h；DAB 显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，于倒置荧光显微镜400 倍镜拍摄，NF-κB、TNF-α、IL-6 阳性表达部位分别是细胞核、细胞膜和细胞质［10-12］。结果判定：呈棕黄染色为阳性表达。应用Image J 图像分析软件统计各组每张切片中5 个不同部位的阳性细胞表达。

2.2.4 RT-PCR 法检测肝组织中ICAM-1、MCP-1 mRNA 相对表达量 每组随机选取6 只小鼠，取肝右叶组织约100 mg 置于含1 mLTrizol 的匀浆管中，按照gDNA wiper 试剂盒说明提取纯化RNA，逆转录为cDNA 后进行荧光实时定量PCR 检测（SYBR荧光染料法），反应条件为：95℃预变性30 s；95℃10 s，60℃30 s，40 个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。反应结束后以GAPDH 为内参基因，采用2-△△Ct法 计 算ICAM-1、MCP-1 mRNA 相 对 表 达量。实验所用引物序列见表1。

表1 引物序列

2.3 统计学方法 数据采用SPSS 22.0 软件进行分析。计量资料属正态分布的以（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD 检验，方差不齐者采用Games-Howell 检验。

3 结 果

3.1 各组小鼠血清ALT、AST水平比较 见表2。

表2 各组小鼠血清ALT、AST 水平比较（xˉ±s） U/L

3.2 各组小鼠肝脏形态肉眼观察比较 正常对照组肝脏呈暗红色，表面光滑平整，质地柔软，未见明显异常；模型组肝脏呈黄白色，表面有明显的点状坏死灶，质地较脆；各剂量组和联苯双酯组小鼠肝脏颜色趋近正常，质地较软，点状坏死灶明显减少。见图1。

图1 各组小鼠肝脏形态肉眼观察图

3.3 各组小鼠肝组织病理形态变化比较 HE 结果显示：正常对照组小鼠肝组织结构清晰可见，肝小叶以及肝细胞完整；模型组小鼠肝组织中央静脉周围出现大量肝细胞坏死及炎性细胞浸润，肝小叶结构被严重破坏；与模型组比较，各剂量组和联苯双酯组肝组织病理损伤均有一定程度的改善。以上结果提示PMG 能显著降低小鼠急性肝损伤程度。见图2。

图2 显微镜下各组小鼠肝组织病理形态变化图（HE，×200）

3.4 各组小鼠肝组织中NF-κBp65、TNF-α、IL-6蛋白表达比较 见表3 和图3～图5。

表3 各组小鼠肝组织中NF-κBp65、TNF-α、IL-6 蛋白表达比较（xˉ±s）

图3 各组小鼠肝组织中NF-κBp65 免疫组化图（×400）

图4 各组小鼠肝组织中TNF-α 免疫组化图（×400）

图5 各组小鼠肝组织中IL-6 免疫组化图（×400）

3.5 各组小鼠肝组织中ICAM-1、MCP-1 mRNA 相对表达量比较 见表4。

表4 各组小鼠肝组织中ICAM-1、MCP-1 mRNA 相对表达量比较（xˉ±s）

4 讨 论

肝脏作为人体内最大的实质性器官，具有物质合成分解代谢、生物的转化和内外分泌等多种功能，故肝脏疾病是临床常见的危害人类健康的疾病，一直是临床研究的重点，而急性肝损伤是几乎所有肝脏疾病的始端［13］。CCl4是一种经典的肝毒性物质，一方面能够破坏肝细胞，使细胞膜通透性改变，导致细胞内ALT、AST 大量进入血液；另一方面可导致肝脏组织结构紊乱、肝细胞坏死和炎症细胞浸润等严重病理改变［14］：因此本实验采用CCl4诱导建立稳定的急性肝损伤动物模型。大黄具有清热泻火、凉血解毒、利湿退黄等功效，自古用作肝脏疾病的治疗。本次实验结果表明PMG 作为大黄的活性成分之一，对CCl4致小鼠急性肝损伤具有较好的保护作用。

TNF-α、IL-6 是炎症反应中主要的促炎因子，在急性肝损伤中发挥重要作用。TNF-α 表达过多可以直接刺激半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族激活，介导肝脏炎性反应，导致肝细胞坏死［15］；IL-6是由单核巨噬细胞分泌的一种多功能炎性因子，当肝脏受损时，过量的IL-6 释放导致肝细胞大量坏死，进而发展为肝纤维化或肝硬化［16］。ICAM-1 是肝脏炎性疾病发展中重要的黏附分子，在多种细胞表面表达，参与白细胞和肝窦内皮细胞的黏附，造成肝细胞损伤，从而促进肝脏炎性反应［17］。MCP-1是一种具有诱导和趋化功能的细胞因子，在急性肝损伤发生发展中，MCP-1 能够诱导单核细胞浸润到肝脏受损部位，进一步加重炎症反应［18］。

NF-κB 是调控炎症反应重要的核心因子，通常与其抑制蛋白（Inhibitory-κB，I-κB）结合为三聚体形式。在肝损伤发生、发展中，I-κB 磷酸化并降解，使NF-κB 暴露出核定位信号，促使NF-κB 由胞浆移位至胞核内。研究发现TNF-α、IL-6、MCP-1以及ICAM-1 等炎症相关因子均含有κB 的结合位点，可结合移位至胞核的NF-κB，其亚基p65 含有转录激活区域，能直接作用于转录元件从而激活一系列炎症相关因子基因的转录过程，使其表达增多［19-20］。

本次实验结果表明：CCl4致急性肝损伤模型小鼠肝组织中可观察到NF-κB的激活，促进了TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1 的表达，从而产生大量的炎性细胞，侵润于损伤的肝组织处，导致急性肝损伤炎性反应过程的发展和加重，从而诱发或加重肝损伤。PMG 保护性干预后，肝组织中TNF-α、IL-6 蛋白表达和ICAM-1、MCP-1 mRNA 相对表达量均明显减少，且细胞核NF-κBp65 蛋白表达亦明显少于模型组，提示PMG 可能通过抑制NF-κB 的活化与核移位，继而减弱了TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1等的生物学效应，从而达到保护肝组织的作用。低、高剂量组血清AST 水平虽明显低于联苯双酯组，但各剂量组血清ALT 水平和肝组织中的NFκBp65、TNF-α、IL-6 蛋白表达及ICAM-1、MCP-1 mRNA 相对表达量与联苯双酯组比较均无统计学意义，提示PMG 的保肝作用与联苯双酯近似。