青光安颗粒剂对兔抗青光眼术后滤过道Beclin1和LC3B表达的影响

刘冬华　汤杰　蒋鹏飞　吕怡　苗大亨　彭俊　彭清华

〔摘要〕 目的 觀察青光安颗粒剂对抗青光眼术后滤过道组织自噬相关蛋白Beclin1/微管相关蛋白轻链B（light chain 3B，LC3B）表达的影响。方法 将30只成功建立慢性高眼压模型的新西兰白兔随机平均分为5组，除空白组（A组）外，其余各组均行常规小梁切除术，阳性对照组（B组）术中放置丝裂霉素C棉片，单纯手术组（C组）仅行常规小梁切除术，青光安组（D组）术后灌胃青光安颗粒剂混悬液，阴性对照组（E组）术后灌胃蒸馏水。干预14 d后，Western blot法检测滤过道组织Beclin1、LC3B-I、LC3B-II的表达量，RT-qPCR法检测Beclin1及LC3B mRNA的相对表达量。结果 各手术组Beclin1蛋白平均表达量均显著高于A组（P<0.05），B组Beclin1蛋白平均表达量显著高于C组、D组与E组（P<0.05），D组Beclin1蛋白平均表达量高于C、E组（P<0.05）;各手术组LC3B-II/LC3B-I均显著高于A组（P<0.05），B组LC3B-II/LC3B-I显著高于C、D、E组（P<0.05），D组LC3B-II/LC3B-I高于C、E组（P<0.05）。各手术组Beclin1 mRNA相对表达量均显著高于A组（P<0.05），B组Beclin1 mRNA相对表达量显著高于C组与E组（P<0.05），B组Beclin1 mRNA相对表达量与D组无明显区别（P>0.05）;各手术组LC3B mRNA相对表达量均显著高于A组（P<0.05），B组LC3B mRNA相对表达量显著高于C组与E组（P<0.05），B组LC3B mRNA相对表达量与D组无明显区别（P>0.05）。结论 青光安颗粒剂能通过促进滤过道组织Beclin1蛋白及mRNA的表达，诱导瘢痕组织的自噬，维持滤过道的通畅。

〔关键词〕 青光眼;青光安颗粒剂;慢性高眼压兔模型;微管相关蛋白轻链B;Beclin1

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.002

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Qingguang’an Granule on the expression of autophagy-related protein Beclin1/light chain 3B （LC3B） in filtration duct tissue after anti-glaucoma surgery. Methods Thirty New Zealand white rabbits successfully established a chronic high intraocular pressure model were randomly divided into 5 groups. Except for the blank group （group A）， all other groups underwent routine trabeculectomy. The positive control group （group B） was placed mitomycin C cotton tablets during operation， the simple operation group （group C） only underwent conventional trabeculectomy， the Qingguang’an group （group D） was given Qingguang’an Granule suspension after surgery， the negative control group （group E） was given distilled water after operation. After 14 days of intervention， Western blot method was used to detect the expression levels of Beclin1， LC3B-I， and LC3B-II in filtration duct tissue， and the relative expression levels of Beclin1 and LC3B mRNA were detected by RT-qPCR. Results The average expression of Beclin1 protein in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， the average expression of Beclin1 protein in group B was significantly higher than that in group C， group D and group E （P<0.05）， and the average expression of Beclin1 protein in group D was significantly higher than that in group C and group E （P<0.05）; LC3B-II/LC3B-I in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， LC3B-II/LC3B-I in group B was higher than that in group C， group D and group E （P<0.05）， LC3B-II/LC3B-I in group D was higher than that in group C and group E （P<0.05）. The relative expression of Beclin1 mRNA in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， the relative expression of Beclin1 mRNA in group B was significantly higher than that in group C and group E （P<0.05）， the relative expression of Beclin1 mRNA in group B was not significantly different from that in group D （P>0.05）; the relative expression of LC3B mRNA in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， and the relative expression of LC3B mRNA in group B was significantly higher than that in group C and group E （P<0.05）， the relative expression of LC3B mRNA in group B was not significantly different from group D （P>0.05）.  Conclusion Qingguang’an Granule can induce the autophagy of scar tissue by promoting the expression of Beclin1 protein and mRNA in the filtration duct tissue， and maintain the patency of the filtration duct tissue.

〔Keywords〕 glaucoma; Qingguang’an Granule; rabbit model of chronic high intraocular pressure; light chain 3B; Beclin1

青光眼是世界排名第二位的致盲性眼病，发病率仅次于白内障，全球约1/2的盲人因青光眼所致[1]。青光眼滤过性手术（glaucoma filtration surgry， GFS）是常见的抗青光眼手术方式，有较好的降眼压作用[2]，但术后滤过道容易瘢痕化导致手术失败。青光安颗粒剂是彭清华教授历经多年研究所研制的中药复方制剂，既往研究表明，青光安颗粒剂能显著降低高眼壓模型兔GFS后滤过道瘢痕化[3-4]，但其具体机制尚不明确。本研究通过构建慢性高眼压家兔模型，观察青光安颗粒剂对GFS后滤过道瘢痕组织自噬相关蛋白Beclin1和微管相关蛋白轻链B（light chain 3B， LC3B）表达的影响，以期能阐明青光安颗粒剂在青光眼滤过手术中抗瘢痕作用的部分机制。

1 材料

1.1  实验动物

40只SPF级新西兰白兔，12周龄，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，动物质量合格证编号：43608300000801。动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF级实验室。

1.2  实验药物与试剂

青光安颗粒剂，按现代制备工艺制成颗粒剂，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。Tris（货号：V900483）、APS（货号：SAB1300902）、SDS（货号：8.17034）、TEMED（货号：1.10732）、Tween-20（货号：P9416）、丙烯酰胺（货号：A9099）、甘氨酸（货号：G7126）、甲叉双丙烯酰胺（货号146072）、Beclin1（货号：SAB1306537）、LC3B（货号：L7543），均购自美国Sigma公司;SuperECL Plus超敏发光液（美国Thermo pierce公司，货号：P1052-100）;逆转录试剂盒（货号：11939823001）、UltraSYBR Mixture（货号：CW2601），均购自中国北京康为世纪生物科技有限公司;核酸染料（中国北京普利莱公司，货号：PB11141）。

1.3  主要仪器

台式冷冻离心机（广东黑马生物科技有限公司，型号：TTGL-18R）;电泳仪（美国Bio-rad公司，型号：T164-5050）;电泳槽（北京六一生物科技有限公司，型号：TDYCZ-24EN）;转膜仪（北京六一生物科技有限公司，型号：TDYCZ-40A）;眼科显微手术器械（日本新芝公司，型号：TDY89-1）;荧光定量RCP仪（美国Thermo公司，型号：TPIKO REAL 96）;荧光PCR板（美国Thermo公司，型号：TSPL0960）;恒温水浴箱（河南金博事业有限公司，型号：THH-S2）;手持裂隙灯（北京六一生物科技有限公司，型号：TDYCP-31DN）;接触式眼压笔（美国Reichert公司，型号：Tono-pen AVIA）。

2 方法

2.1  慢性高眼压兔模型建立[5]

前房注射2%透明质酸钠0.2 mL，每周1次，连续两周以建立高眼压模型，使用Tono-pen AVIA 接触式眼压笔，于早上9：00至12：00间进行眼压测量，眼压连续1周高于22 mmHg（2.93 kPa）为造模成功。

2.2  青光眼滤过手术动物模型建立[6]

缩瞳后以2.0%戊巴比妥麻醉动物，充分麻醉后以开睑器撑开眼球，以鼻上方穹隆部为基底制作结膜瓣，以角膜缘为基底制作巩膜瓣，切除小梁及周边虹膜组织;10-0缝合线缝合巩膜;调整巩膜缝线直至巩膜瓣滤过通畅。连续缝合结膜，涂典必殊眼膏（比利时爱尔康公司，规格：3.5 g，每次涂1 cm长的药膏）。手术动物模型的建立由同一人完成，从手术后第2天起，每日给术眼点典必殊滴眼液（比利时爱尔康公司，规格：5 mL，每次1滴）4次，复方托吡卡胺滴眼液（日本参天制药株式会社，规格：10 mL，每次1滴）1次。

2.3  实验分组

成功建立慢性高眼压兔模型后，剔除不符合标准（3只）及死亡的兔子（2只）后，最终随机数字表法选取30只模型兔，分为5组，其中空白组（A组）、阳性对照组（B组）、单纯手术组（C组）、青光安组（D组）和阴性对照组（E组）各6只。

2.4  动物给药

A组动物不做特殊处理;B组动物行常规小梁切除术后，术中待巩膜瓣切好后，于巩膜瓣与结膜瓣处置入0.4 mg/mL丝裂霉素C棉片，定时3 min后予以大量生理盐水充分冲洗;C组动物仅行常规小梁切除术;D组动物行常规小梁切除术，术后第1开始予以青光安颗粒剂中药混悬液灌胃，按10 mL/kg 给药，2次/d，连续给药14 d;E组动物行常规小梁切除术，术后第1天开始每日予以青光安颗粒剂同等容量的蒸馏水灌胃，2次/d，连续14 d。

2.5  取材方法

术后第15天处死动物，取右眼球滤过泡处角巩膜组织约0.025 g，清洗组织，常规用冰预冷PBS，然后加入RIPA裂解液（200 μL），再将组织置于匀浆器中反复研磨，直至组织块消失;然后经过裂解、离心15 min（半径为95 mm，转速为12 000 r/min），再取0.5 mL所得上清液分装转移，置于离心管中，部分剩余者留存备用，保存于-20 ℃左右，待需要时取出测定蛋白浓度。

2.6  Western blot法检测Beclin1、LC3B蛋白表达

上样后，将已变性蛋白进行电泳。浓缩胶电泳需要80 V电压，分离胶电泳电压比浓缩胶电泳高40 V。当溴酚蓝电泳至胶底部时可停止。然后进行转膜、一抗孵育（稀释比例为1∶1000）、二抗孵育（稀释比例为1∶6000）等步骤后，予以显像曝光，得出最后结果。

2.7  RT-qPCR检测Beclin1和LC3B mRNA表达

取0.02 g组织，加入1 mL Trizol用匀浆器研磨匀浆充分混匀，提取总RNA，以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA。引物设计与合成：Beclin1上游5’-TGCCCTATGGAAATCACTCGT-3’，下游5’-GTCT⁃

CGCCCTTTTCAACCTC-3’，基因产物长度168  bp;LC3B上游5’-ACGTCCACCCAATCAGTCC-3’，下游5’-TTACTGGCGACTCAGAATGCAA-3’，基因产物长度172 bp;内参基因GAPDH上游5’-TGGAATCCACT⁃

GGCGTCTTCAC-3’，下游5’-AGGATGCGTTGC⁃

TGACAATCTTGA-3’，基因产物长度195 bp。制定实时定量PCR反应体系：使用iQ5 PCR仪进行PCR扩增。扩增程序如下：95 ℃预变性10 min，95 ℃预变性3 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。扩增完成后进行熔解曲线分析及相对表达量分析，△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct;-ΔΔCt=（对照组）ΔCt-各样品ΔCt。

2.8  统计学方法

采用SPSS 25.0系统软件进行实验数据分析，实验数据以“x±s”表示：两两比较采用成组t检验或秩和检验;多组比较采用ANOVA（LDS）检验。均以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1  术后第1天滤过泡情况

术后各组兔子右眼结膜稍有充血，角膜清，无混浊水肿，前房内无积血，右眼滤过泡，扁平弥散，滤过通畅。见图1。

3.2  青光安颗粒剂对Beclin1、LC3B-I、LC3B-II蛋白表達及LC3B-II/LC3B-I的影响

各手术组Beclin1蛋白平均表达量均显著高于A组（P<0.05），B组Beclin1蛋白平均表达量显著高于C组、D组与E组（P<0.05），D组Beclin1蛋白平均表达量高于C、E组（P<0.05）;各手术组LC3B-I蛋白平均表达量均显著低于A组（P<0.01），B组

LC3B-I蛋白平均表达量低于C组、D组与E组（P<0.05），D组LC3B-I蛋白平均表达量低于E组（P<0.05）。各手术组LC3B-II蛋白平均表达量均显著高于A组（P<0.05），B组LC3B-II蛋白平均表达量显著高于C、D、E组（P<0.05），D组LC3B-II蛋白平均表达量高于C、E组（P<0.05）;各手术组LC3B-II/LC3B-I均显著高于A组（P<0.05），B组LC3B-II/LC3B-I显著高于C、D、E组（P<0.05），D组LC3B-II/LC3B-I高于C、E组（P<0.05）。见表1、图2-3。

3.3  青光安颗粒剂对Beclin1、LC3B mRNA相对表达量的影响

各手术组Beclin1 mRNA相对表达量均显著高于A组（P<0.05），B组Beclin1 mRNA相对表达量显著高于C组与E组（P<0.05），B组Beclin1 mRNA相对表达量与D组无明显区别（P>0.05）;各手术组LC3B mRNA相对表达量均显著高于A组（P<0.05），B组LC3B mRNA相对表达量显著高于C组与E组（P<0.05），B组LC3B mRNA相对表达量与D组无明显区别（P>0.05）。见表2。

4 讨论

目前，GFS是临床常用的抗青光眼手术方式之一，其原理是通过人为的建立滤过通道来到达控制眼压的目的，但是需要手术区的切口不完全愈合才能长久的维持有效滤过，滤过手术后滤过道瘢痕的增生常常导致滤过手术的失败[7]。为此，国内外眼科学者积极致力于青光眼滤过手术后抗瘢痕药物的研制。目前，用于青光眼滤过手术后抗瘢痕的药物有抗代谢药、抗凝血类药物、拮抗生长因子药物、类固醇与非甾体类抗炎药和中药等。中药相对其他几种药物而言，毒副作用相对较小，因此成为了当下研究的热点。

彭清华教授团队历经多年研究探索，认为青光眼的中医核心病机为“气阴两虚，脉络瘀滞，玄府闭塞，神水瘀积”[8-10]，“益气养阴、活血利水”是青光眼的中医治疗基本大法，并据此法研制出青光安颗粒剂[11]。该颗粒剂由黄芪、白术、茯苓、生地黄、地龙、红花、赤芍及车前子等药物组成。前期临床研究表明，青光安颗粒剂可明显降低眼压[12-13]，对青光眼术后滤过功能的长远维持有明显帮助[14]，其4种有效组分均能在小梁切除术后通过抑制Tenon嚢成纤维细胞的表达减少滤过泡瘢痕形成[15]，且未发现青光安颗粒剂4种有效组分对眼部组织的毒副作用，说明其安全性优于传统药物，可能成为提高GFS成功率的一个安全有效的全新药物。

目前，青光安颗粒剂减少滤过泡瘢痕形成的分子机制尚不清楚，本实验以自噬为切入点，通过检测自噬相关靶点蛋白Beclin1、LC3B及其mRNA的表达，探讨了青光安颗粒剂对在自噬水平上对GFS后的抗滤过道瘢痕作用。Western blot检测显示：B组与D组瘢痕组织中Beclin1蛋白含量和LC3B-II/LC3B-I明显升高;RT-qPCR检测结果显示：B组与D组瘢痕组织中Beclin1 mRNA明显升高，D组LC3B mRNA相对表达量虽然高于C组和E组，但差异无统计学意义，这可能与LC3B不能灵敏地评价自噬的发生有关。从Beclin1及LC3B-II/LC3B-I表达结果来看，青光安颗粒剂与丝裂霉素C均能提高滤过道自噬，从而阻止滤过道瘢痕化。

滤过道的自噬可减少瘢痕组织的形成，而Beclin1、LC3B-I及LC3B-II是瘢痕组织自噬的关键靶点蛋白，Beclin1可明显促进自噬体膜的形成，是自噬启动的核心分子，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，Beclin1缺乏会导致自噬活性受到明显抑制[16]。在Beclin1介导的自噬性细胞死亡过程中，LC3B可以为自噬泡膜的延长贡献作用，最终促使自噬体成熟，LC3B在细胞内分别以LC3B-I和LC3B-II两种形式存在，LC3B-I是LC3B-II的前体蛋白，活化后即为LC3B-II，因LC3B-II定位于前自噬体和自噬体，其含量与自噬泡的数量呈正相关，随自噬体系膜的增加而增加，为了消除测量绝对数值对结果的影响，目前，多以LC3B-II/LC3B-I来作为评价自噬是否正常发生的指标，LC3B-II/LC3B-I在一定程度上代表了细胞的自噬活性。

综上，青光安颗粒剂能通过促进滤过道组织Beclin1的表达，提高LC3B-II/LC3B-I比值，诱导瘢痕组织的自噬，从而减少滤过泡瘢痕形成，维持滤过道的通畅。

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