高效液相色谱法测定猪血制品中苋菜红、新红、胭脂红和诱惑红

毕 娜，高 晗，杨晓赫

（吉林市食品药品检验所，吉林吉林 132000）

猪血又称血豆腐、血花、血红和血旺等，是一种高蛋白、低脂肪、低糖而微量元素含量丰富的食品工业副产品[1]。猪血制品颜色多为深暗红色，色泽是食品感官质量的指标之一，色泽鲜艳能够增加消费者的购买欲望[2-5]。因此，为改善猪血制品的色泽，生产者在制作猪血制品过程中通过添加色素来实现。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》 （GB 2760—2014）规定，畜禽血制品中允许添加的添加剂有氯化钙，聚二甲基硅氧烷及其乳液，并且有明确规定的最大使用量。可添加苋菜红、新红、胭脂红、诱惑红的食品名称项下均不包括猪血制品。因此，在猪血制品中添加色素属于超范围添加。《食品安全国家标准 食品中诱惑红的测定》（GB 5009.141—2016）适用于汽水、硬糖、糕点和冰淇淋。《肉制品胭脂红着色剂测定》（GB/T 9695.6—2008）适用于肉制品。SN/T 1743—2006 规定，采用高效液相色谱法测定食品中诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量适用于糖果、饮料。《出口火锅底料中多种合成色素的测定》（SN/T 3845—2014）适用于火锅底料。综上，食品检测标准中没有包含检测猪血制品中色素的相关检测方法[6-10]。因此，建立猪血中多组分色素的检测技术十分必要。本方法建立了高效液相色谱法同时测定猪血制品中苋菜红、新红、胭脂红和诱惑红的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

水相微孔滤膜：0.22 μm；塑料离心管：50 mL。

1.2 试剂与仪器

甲醇（色谱纯）；娃哈哈纯净水；乙酸铵；无水乙醇；氨水；标准品：新红（1 000 μg·mL-1）；苋菜红、胭脂红和诱惑红浓度均为1.00 mg·mL-1，中国计量科学研究院。

岛津LC2030C 高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器；METTLER MS105DU 电子天平；MX-F漩涡振荡器，CRAGONLAB；Z36HK 离心机，HERMLE Labortechnik Gmbh。

1.3 混合标准溶液的制备

分别准确吸取苋菜红、新红、胭脂红、诱惑红标准溶液适量于同一10 mL 量瓶中，用水定容至 10 mL，得到苋菜红、新红、胭脂红、诱惑红浓度均为100 μg·mL-1的混合标准使用液。

1.4 样品前处理

准确称取2 g 样品于50 mL 离心管中，准确加入20 mL 无水乙醇-氨水-水（7 ∶2 ∶1）提取，漩涡振荡10 min，水浴超声提取10 min，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液10 mL，70 ℃水浴浓缩至近干，用水溶解并定容至5 mL。经0.22 μm 滤膜过滤，滤液待测。

1.5 色谱条件

色谱柱：Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：1 mL·min-1；流动相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵，梯度洗脱，洗脱条件见表1；检测波长：510 nm。

表1 梯度洗脱条件

2 结果与分析

2.1 提取方式的确定

提取过程中，提取液分别采用水和无水乙醇-氨水-水（7 ∶2 ∶1）进行提取。用水提取时，受杂质干扰较大，无法有效分离目标峰。而用无水乙醇-氨水-水（7 ∶2 ∶1）提取时，采用1.4 步骤进行样品前处理，分离度、回收率均较好，故采用无水乙醇-氨水-水（7 ∶2 ∶1）提取。水和无水乙醇-氨水-水提取样品的图谱见图1、图2。

图1 用水提取样品时的色谱图

图2 用无水乙醇-氨水-水（7 ∶2 ∶1）提取样品时的色谱图

2.2 波长的确定

经紫外扫描，苋菜红、新红、胭脂红和诱惑红最大吸收波长分别为509 nm、522 nm、510 nm 和510 nm。经实验，混合组分采用同一波长检测，检测波长为510 nm，各组分响应值均较好，灵敏度高。

2.3 标准曲线、线性范围及检出限

准确量取混合标准溶液0.01 mL、0.05 mL、0.10 mL、1.00 mL 和5.00 mL 于5 个10 mL 量瓶中，并用水定容至刻度，配制成苋菜红、新红、胭脂红、诱惑红浓度均为0.1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的混合标准系列溶液。分别取混合溶液10 μL，按1.5 条件，进行检测。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线方程，外标法定量。由表2 可知，4 种被测物质在0.1 ～100.0 μg·mL-1线性良好，相关系数r均为 1.000 0。取已知浓度的标准溶液，通过逐级稀释不断进样，直至检测物质为3 倍基线噪声时，此时的浓度即为检出限，3 倍检出限即为定量限。4 种色素检出限均为0.05 mg·kg-1，定量限均为0.15 mg·kg-1。

表2 混合标准溶液浓度、标曲、相关系数、检出限及定量限

2.4 加标回收率及精密度

选择低、中、高3 个不同浓度，将已知含量的标准溶液加入样品中，每水平处理4 个样品，将样品过0.22 μm 混合滤膜后，按1.5 条件进行检测，记录峰面积计算回收率平均值，得加标回收率。由表3 可知，4 种被测组分的回收率在81%～102%，在重复性条件下，获得的4 次独立测定结果的绝对差值均小于算数平均值的20%。选择低、中、高3 个不同浓度，将已知含量的标准溶液加入样品中，每个浓度处理一个供试品，每个供试品溶液重复进样6 次，按1.5 条件进行检测，记录峰面积计算6 次结果的相对标准偏差结果，4 种被测组分的精密度在0.2%～0.9%，表明仪器稳定性良好。

表3 4 种色素在猪血制品中回收率及精密度

3 结论

本文建立了HPLC测定猪血制品中苋菜红、新红、胭脂红、诱惑红含量的方法。所建立的分析方法前处理简单，检测效率高，能满足分析要求。