汪晓纯,袁紫仪,顾 悦,郭庆宇,王 涛,续凯欣
(1.黑龙江八一农垦大学 食品学院,黑龙江大庆 163000;2.沈阳农业大学 食品学院,辽宁沈阳 110866;3.东北农业大学 食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)
近年来,在国家和科研工作者的努力下,食品添加剂的开发取得了质的飞跃,目前国内市场已有多种特殊功能的天然食品添加剂和人工合成的食品添加剂。食品添加剂就是一把双刃剑,既有优点也有缺点。食品添加剂增加了食品的种类,保持和提升了食品的营养价值。但是一些食品添加剂在使用过程中会产生副产物,有些副产物在人体内累积到一定程度,会使人体机能受到损害;且食品添加剂的超范围、超剂量使用也会对人体产生巨大的安全隐患。由此可见,食品添加剂与人体健康息息相关,已经成为一项威胁人体健康不可忽视的因素。其中,增稠剂主要用于改善和增加食品的黏稠度,保持流态食品、胶冻食品的色、香、味和稳定性,改善食品物理性状,并能使食品有润滑适口的感觉[1-5]。因此,食品中应用各种增稠剂的安全性也亟待验证,以便更好地应用于食品工业。
黑腹果蝇是生物学研究中最重要的模型生物之一,具有体积小、易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短(约两周)、繁殖力强以及子代数量多等优势。超过60%的人类疾病基因在果蝇中有直系同源物。因此,20 世纪70 年代以来,黑腹果蝇在发育生物学、神经科学、人类疾病研究等领域得到了广泛应用,随着科学的发展和研究手段的不断进步,在未来果蝇将会作为一种理想的模式生物在各个领域发挥其作用[6-7]。本研究通过喂食果蝇6 种增稠剂,并观察果蝇的体积、体重、爬行能力和后代存活率等指标分析增稠剂对果蝇生长的影响。
本实验根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)挑选10 种增稠剂,经过梯度浓度增稠剂配制果蝇培养基筛选,以50 只雌果蝇产卵两天,孵化成虫数量达到50 只以上为标准,最终得到6 种增稠剂的果蝇培养数据。
培养基配制采用2x 果蝇浓缩的基础培养基稀释配制,基础培养基1 L 成分为玉米粉71.2 g、酵母粉16.8 g、黄豆粉9.8 g、琼脂5.6 g、水600 mL、麦芽糖饴75 mL、麦芽汁400 mL 等。对照组为2x 培养基∶水=1 ∶1 稀释配制;实验组为2x 培养基∶增稠剂水溶液=1 ∶1 混合配制,实验组培养基增稠剂的最终浓度分别为5%紫胶酸、5%蔗糖硬脂酸酯、3%卡拉胶、3%罗望子胶、3%藻酸丙二醇酯和3%海藻酸钠。接种果蝇为w1118野生型果蝇,50 只雌果蝇,50 只雄果蝇接卵48 h,25 ℃培养,湿度60%,12 h 昼夜交替。
解剖镜,日本Olympus;正置荧光显微镜,德国Leica;电子分析天平,上海恒平仪器;纯水仪,上海雷磁电科学仪器;生化培养箱,哈尔滨东联仪器。
1.3.1 三龄幼虫的发育情况测定
收集在不同培养基中产卵4 d 后孵化的三龄幼虫,冷冻处理14 h 后放置于干净的载玻片上,用毛刷将其摆放整齐,每组收集20 只在显微镜下拍照,用刻度尺测量并拍照记录。根据以下公式计算蛹的相对体积V1。
式中:L1为三龄幼虫长度,mm;I1为三龄幼虫宽度,mm。
1.3.2 蛹的发育情况
收集不同培养基中已经孵化成蛹的果蝇,放置于干净的载玻片上,用毛刷将其摆放整齐,每组20只在显微镜下拍照并记录。根据以下公式计算蛹的相对体积V2。
式中:L2为蛹长度,mm;I2为蛹宽度,mm。
1.3.3 成虫爬行能力的测定
根据李娜等[8]测定果蝇的爬行能力的方法,收集不同培养基中羽化后的雄性成虫取20 只分别放入量筒中,将果蝇磕至空量筒底部,并同时开始计时至15 s 时,数出15 s 时果蝇爬过12 cm 线的只数,每组做3 次平行实验。
1.3.4 雄性成虫果蝇重量的测定
收集不同培养基中羽化后的雄性成虫,每组样品取20 只,使用分析天平称重记录数据,每组做3次平行实验。成虫平均体重=总质量/称重只数。
1.3.5 雌果蝇受精卵的孵化率的测定
收集不同培养基中雌性果蝇20 只,将其放在苹果汁培养基中培养,记录其产卵数,4 ~5 d 后记录其孵化卵数。计算出果蝇的孵化率,每组做3 次平行实验。孵化率=(孵化数/产卵总数)×100%。
1.3.6 数据分析
果蝇显微图像采用ImageJ 软件分析测量果蝇幼虫和蛹的长度和宽度;GraphPad Prism 6.0 软件进行统计学分析。
2.1.1 三龄幼虫期
果蝇从受精卵孵化成一龄幼虫仅需24 h,从一龄幼虫期到达三龄幼虫期需2 ~3 d,三龄幼虫的形体状态稳定,便于观察与测量[9]。实验结果显示,在幼虫期增稠剂卡拉胶、罗望子胶、藻酸丙二醇酯和海藻酸钠的体积显著减小(图1)。其中罗望子胶组体积下降28.4%,卡拉胶组下降21.8%,海藻酸钠组下降16.5%,藻酸丙二醇酯组下降了10.3%。另外,紫胶组和蔗糖硬脂酸酯组幼虫体积分别增加38.3%,65.2%(表1)。研究结果表明不同增稠剂对果蝇幼虫期的大小影响存在差异。
表1 喂食增稠剂果蝇幼虫体积变化
图1 增稠剂喂食果蝇的三龄幼虫状态(标尺为500 μm)
2.1.2 蛹期
果蝇变态发育的第二个阶段为蛹期,此阶段的果蝇大小直接决定成虫体型,通过进一步观察果蝇蛹体积的大小,分析增稠剂对果蝇生长的影响至关重要。实验结果显示,卡拉胶组减少53.3%,罗望子胶组减少42.4%,海藻酸钠组减少了38.1%,藻酸丙二醇酯减少了25.8%。此外,紫胶组和蔗糖硬脂酸酯蛹体积分别增加了34.7%和32.5%(图2 和表2)。通过幼虫与蛹的体积分析,发现增稠剂紫胶和蔗糖硬脂酸酯对果蝇的生长起到了持续促进的效果,而卡拉胶、罗望子胶、藻酸丙二醇酯和海藻酸钠抑制了果蝇的幼虫期与蛹期的生长。
图2 增稠剂喂食果蝇的蛹期状态(标尺为500 μm)
表2 喂食增稠剂的蛹体积变化
果蝇经过幼虫期和蛹期的生长最终羽化成成虫,成虫继续在增稠剂培养基中生活7 d。由于雌性成虫受激素的影响较大,因此选择羽化7 d 的雄果蝇测量体重,持续观察增稠剂对果蝇体重的影响。实验结果表明,与对照组相比卡拉胶组、罗望子胶组和海藻酸钠组的平均体重分别下降了0.11 mg、0.09 mg和0.12 mg,而紫胶组和蔗糖硬脂酸酯组的平均体重分别增加了0.10 mg 和0.05 mg(图3)。因此,增稠剂对果蝇的生长影响持续到了成虫期,而不同的增稠剂的影响效果不同。
图3 增稠剂对成虫期雄果蝇的体重影响
为了进一步观察增稠剂对果蝇后代存活率的影响,通过分别搜集200 只雌果蝇,50 只雄果蝇自由交配48 h,计算产卵的孵化率。结果显示,增稠剂组的后代活力显著下降,与对照组的93.2%的孵化率相比,紫胶组下降了28.2%,蔗糖硬脂酸酯组下降了12.2%,卡拉胶组下降了11.2%,罗望子胶组下降了37.1%,藻酸丙二醇酯组下降了52.4%,海藻酸钠组下降了14.1%(图4)。以上结果说明,增稠剂对于后代的存活率的影响严重,可较大程度地降低受精卵的孵化率。
图4 增稠剂对成虫后代的存活能力的影响
爬行能力是果蝇运动活力的关键,通过观察果蝇的爬行能力,可以分析增稠剂对果蝇的机械活动能力的影响,进一步评价果蝇的生长状态。本实验通过测量20 只雄果蝇15 s 内爬过12 cm 距离的通过率分析果蝇的爬行能力。研究结果表明,喂食增稠剂的实验组果蝇成虫的爬行能力受到不同程度的影响,其中紫胶组的通过率下降了22.8%,蔗糖硬脂酸酯组下降了27.8%,卡拉胶组下降了61.1%,罗望子胶组下降了47.8%,藻酸丙二醇酯组下降了54.5%,海藻酸钠组通过率下降了40.1%(图5)。以上结果说明,增稠剂抑制了果蝇的运动能力,通过率普遍降低。
图5 增稠剂对果蝇爬行能力的影响
本实验研究表明,喂食果蝇6 种增稠剂对果蝇幼虫期、蛹期与成虫期的生长发育存在不同程度的影响,其中卡拉胶、罗望子胶和海藻酸钠显著抑制了果蝇的生长发育。表现为幼虫和蛹的体积变小、体重下降、后代存活率降低以及爬行能力降低。在食品工业生产中应用此种增稠剂存在一定的安全风险,为进一步规范使用食品添加剂提供理论参考。