一种阿尔茨海默病大鼠模型的建立*

孟 雪 贾 璞 郑晓晖 王世祥 骆 晶

(1. 陕西省中医药研究院中药研究所，西安 710003)(2. 西北大学生命科学学院，西安 710069)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性认知障碍和记忆力损害为主的神经系统退行性疾病。我国每年治疗AD患者的直接费用和间接费用合计高达1万多亿元，给家庭和社会带来沉重负担[1]。目前，AD发病机制尚无定论，病因有β-淀粉样蛋白异常沉积、胆碱能损伤学说、Tau蛋白过度磷酸化、氧化应激等[2]。复杂病因使得基于药物靶标的AD西药研发进展缓慢。因此，中药复方多途径协同起效，防治AD的独特优势日益受到重视。良好的病理模型是AD新药研发临床前研究的基础[3-4]。由于其疾病本身的复杂性，单一病理因素模拟下的AD动物模型无法复制该病的整体症状，越来越多的研究趋向于复合造模。D-半乳糖(D-gal)可在脑组织中形成淀粉样斑块，诱导神经细胞老化、损伤等[5-6]。Anil等[7]报道，铝是慢性蓄积性神经毒物，动物实验表明铝会导致神经病理、神经行为及神经化学的改变，从而导致记忆能力损伤。因此，本研究选择皮下注射氯化铝(AlCl3)和腹腔注射D-gal的复合造模方法，制作一种创伤小、周期短且易操作，但接近真实病理状况的AD大鼠模型，通过经典Morris水迷宫实验及大鼠脑内乙酰胆碱酯酶(AchE)水平检测对模型进行评价。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠，SPF级，20只，体质量220～240 g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(粤)2018-0002。饲养于清洁级环境，温度(21±2)℃、相对湿度为(50±2)%，明暗交替周期为12 h/12 h，大鼠自由进食和饮水。本实验通过陕西省中医药研究院中药研究所福利伦理审查，审查编号：CAP2017(A)0029-2019，伦理审查意见第503号。

1.2 试剂

AlCl3购自天津市大茂化学试剂厂，D-gal购自Sigma，AchE测定试剂盒及总蛋白定量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器

Spectra Max 340PC型酶标仪：Molecular Devices；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司。Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所提供，水池为不锈钢制品，直径120 cm，高50 cm，水深25 cm，水池内壁为黑色，配套有机玻璃圆形平台(直径12 cm、高20 cm)。水迷宫正上方安装有摄像机，连接计算机后，可以即时跟踪和拍摄大鼠的运动轨迹，并将记录数据发至电脑系统，图像自动采集系统和SMART2.5.20水迷宫视频分析软件：Panlab。

1.4 建立动物模型

大鼠随机分成正常组和模型组，每组10只。模型组腹腔注射D-gal，给药剂量60 mg/kg；同时皮下注射AlCl3水溶液，给药剂量为100 mg/kg，1次/d，连续45 d，建立AD大鼠模型。

1.5 行为学测试

1.5.1Morris水迷宫适应训练：造模完成后，进行1 d水迷宫适应训练，每只大鼠训练2次。圆形水池被等分为4个象限，定为1、2、3、4象限，平台定为第5象限。大鼠从不同象限入水，如果90 s找不到站台，则人为引导至站台，停留20 s。每次训练完成后，迅速将大鼠用洁净毛巾擦拭干净，轻轻放回笼盒，减少其应激反应。

1.5.3空间探索实验：进行4 d的定位航行实验后，大鼠对于水迷宫测试已经比较熟悉，所以选择第5天进行大鼠空间探索实验。撤除平台，选择原平台象限(第4象限)的对侧象限，即第2象限入水，记录大鼠在90 s内跨越原平台(第5象限)的次数。由软件系统自动分析水迷宫内大鼠的航行轨迹，记录大鼠在第4象限的停留时间和游泳距离。

1.6 AchE活性检测

水迷宫测试完成后，大鼠处死，取脑组织，冷生理盐水冲洗，称质量后，以每克组织加入9 mL生理盐水的比例计算，冰浴条件下用玻璃匀浆机充分研磨，将制得的10%脑匀浆液，4 ℃下3 500 r/min离心10 min，吸取上清液。总蛋白含量选取BCA法进行，按照蛋白含量测定试剂盒方法进行，计算出总蛋白含量。AchE检测，严格按照试剂盒测定方法进行。AchE活力值的定义为：(组织蛋白样本/ng)在37 ℃孵育6 min，水解反应体系中1 μmoL基质为1个活力单位。

1.7 统计学处理方法

2 结果

2.1 行为学测试

2.1.1模型死亡率：模型死亡率为0。

2.1.2定位航行实验：结果见表1。第1天，正常组与模型组的潜伏期时间最长，随着天数增加，两组大鼠的逃避潜伏期都逐渐缩短，例如：第4天和第3天的逃避潜伏期接近。将两组每天的潜伏期进行比较，模型组均高于正常组(P<0.01)；4 d潜伏期平均值比较发现，模型组的大鼠潜伏期与正常组比较，差异极显著(P<0.01)，模型组潜伏期延长约10 s。

表1 大鼠逃避潜伏期测定结果

2.1.3空间探索实验：结果见表2，模型组大鼠穿越原平台次数仅为2.1次，明显低于正常组大鼠的5.1次(P<0.01)；模型组大鼠在平台所在象限的游泳时间百分比和距离百分比，分别是(44.87±3.47)%和(42.97±3.91)%，分别高于正常组的(28.09±4.64)%和(29.86±5.91)%，且差异极显著(P<0.01)。

表2 大鼠空间探索实验测定结果

2.2 AchE活性测定

大鼠大脑AchE活性测定结果见表3。模型组的AchE酶活力升高，与正常组相比，差异极显著(P<0.01)。

表3 大鼠大脑AchE活力测定结果

3 讨论

Morris水迷宫是一种检测大鼠学习记忆能力的经典行为学考察方法，实验数据精确，对动物损害较小，相比较其他记忆测试实验，能系统全面地考验动物空间认知加工过程[8]。定位航行实验结果表明，模型组大鼠潜伏期明显延长；空间探索实验中，在目标象限中游泳距离和时间延长，但是穿越平台次数显著减少，与定位航行实验结果基本一致，提示模型组动物学习记忆能力下降。中枢胆碱能系统与学习记忆关系密切，AD患者的中枢神经系统胆碱神经功能明显下降，乙酰胆碱(Ach)为促进学习记忆的重要的神经递质，AchE是表征脑胆碱能系统功能完善、良好的重要标志酶，其活性变化能间接反映Ach在脑中的变化[9]。本研究中，AD模型大鼠脑内AchE活力升高，说明动物胆碱能系统功能受损。综上可知，通过D-gal和AlCl3复合造模方法复制AD模型大鼠，能够复制AD临床病理特征，为防治AD中药新药临床前研究提供合格模型动物。

AD致病因素较多，针对各病因建造的动物模型也较多[10]。目前，AD病理模型主要有以下几种：物理方法(如基底核损坏等)、化学方法(β淀粉样蛋白注射、D-gal、AlCl3)等损毁病理模型；复合动物模型；快速老化小鼠模型；转基因动物模型等，但是这些模型均有一定不足之处，如Aβ损害模型，造模时注射方式会对脑组织形成不可逆地穿透损伤，且随着给药时间的延长，体内会自动清除注射的Aβ，无法维持长时间实验周期。脑是AD疾病的主要病位，某些损毁模型，对动物脑部造成创伤较大，间接干扰实验结果。快速老化小鼠和转基因动物模型则较为昂贵，因此制作复合模型与单因素模型比较而言，更能复制AD疾病复杂的临床病理变化，且造价较低，对动物损伤小，易于操作造模。

D-gal可对机体产生氧化损伤，从而导致脑部神经细胞结构发生改变、脑内正常的生理功能降低，使模型近似于人类自然衰老，产生相近的生理生化功能改变，使得学习记忆能力下降[11]。铝属于慢性毒物，具有神经毒性作用，可导致神经纤维缠结和脑内淀粉样斑块生成[12]。杨坦[13]报道采取灌胃AlCl3结合腹腔注射D-gal制作AD模型，但以小鼠为多见，大鼠模型较少。由于中药复方多为汤剂口服给药，长期灌胃AlCl3对胃肠刺激可能影响口服药物的吸收，间接影响药效实验结果。罗红波等[14]采用灌胃AlCl3和腹腔注射D-gal制作复合模型大鼠，采取Y-迷宫实验检测模型大鼠学习记忆能力下降，已证实该造模方法可以促使海马部位老年斑增多，但未对胆碱能系统影响进行研究。因此，本研究采用Morris水迷宫及脑内AchE检测对模型建立成功与否，进行行为学考察和病理指标评价，进一步验证该AD模型合理性。