癌细胞膜伪装的纳米递药系统的初步构建与评价

杨洪宾,余真妍,闫 洁,纪帅帅,杨梦婷,胡 嫚,王子吟,霍 强,程 秀(蚌埠医学院药学院药物化学教研室,蚌埠 233000;通讯作者,E-mail:620793985@qq.com;共同通讯作者,E-mail:93703312@qq.com)

肺癌是严重威胁人们健康的恶性肿瘤之一[1]。化疗仍然是主要的治疗方式,但是化疗药物具有水溶性低、稳定性差等缺点,严重影响各种化疗药物的应用[2]。例如,槲皮素是一种来源广泛的黄酮醇类化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等多重作用,但同样存在上述弊端[3,4]。目前研究多采用纳米靶向制剂搭载化疗药物,增强药物到达病灶的有效浓度[5]。例如,Gui等[6]制备了超顺磁性氧化铁纳米粒子,优化了紫杉醇的不良性质,避免了药物过早的破坏,提高了药物的靶向富集。但常规的靶向制剂仍然存在易被体内吞噬系统识别破坏和靶向性不足等缺点[7]。目前,通过细胞膜包裹构建仿生纳米载体可以进一步解决上述存在的不利之处。从最初利用红细胞膜[8]包裹纳米粒子进行给药,避免巨噬细胞的摄取,延长药物体循环时间,到后来利用巨噬细胞[9]、中性粒细胞[10]、T细胞[11]、癌细胞[12]与细菌[13]等提取细胞膜用于包裹粒子构建仿生纳米载体。其中,癌细胞膜有别于其他膜材料,具有很好的同源靶向性和逃避免疫系统识别能力,作为仿生膜材料具有独特的优势[14]。其次,沸石咪唑骨架(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)是金属有机骨架(MOFs)的一个重要亚类,以其优异的载药量和pH响应性,被确认为一种性能优越的载体,并被广泛用于药物的靶向递送[15]。因此,本研究通过肺癌细胞膜(lung cancer cell membrane,CM)包裹咪唑骨架材料构建仿生药物,旨在探讨仿生类的材料能否发挥隐形作用和肿瘤靶向作用,从而为肺癌的治疗构建一种能够良好靶向肿瘤部位发挥疗效的仿生纳米载体。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

肺癌细胞株A549细胞(中国上海科学院);BALB/c裸鼠(常州卡文斯实验动物有限公司);槲皮素、六水合硝酸锌(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);2-甲基咪唑(东京化成工业株式会社,日本);0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Gibco,美国);F12培养基(大连美仑生物科技有限公司);胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司);青霉素-链霉素溶液、细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(江苏碧云天生物技术公司);Matrigel基质胶(Corn-ing,美国);Cy5荧光染料(上海经科化学科技有限公司)。

1.2 动物与细胞培养

A549细胞在含10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素溶液的F12培养基中培养,37 ℃,5%的CO2细胞培养箱中培养。4～5周龄的BALB/c雄性裸鼠饲养于蚌埠医学院实验动物中心,并获得蚌埠医学院实验动物中心伦理批准。

1.3 仿生纳米载体的构建

1.3.1 提取A549细胞膜 细胞刮收集A549细胞,离心弃上清(900 r/min,5 min,4 ℃),用预冷的PBS清洗3次。取细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒中的试剂A 1 ml重悬细胞,冰浴15 min后,细胞悬液反复冻融3次。离心取上清(700 r/min,10 min,4 ℃),将上清离心(14 000 r/min,30 min,4 ℃),所得沉淀即为癌细胞膜,置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 制备CMD-ZIF-8@QT 根据先前报道的方法[16]采用一锅包封法制备载药纳米粒子,取970 mg的二甲基咪唑,50 mg的槲皮素溶于10 ml甲醇中,搅拌5 min,使其充分混合,另取50 mg的六水合硝酸锌溶于5 ml甲醇中,并将六水合硝酸锌逐滴加入到上述溶液中搅拌2 h,之后10 000 r/min,10 min,4 ℃离心,弃上清,甲醇浸洗2次,去离子水浸洗2次。冻干得ZIF-8@QT。将CM、二硬脂酰基乙醇胺(distearoyl phosphoethanolamine,DSPE)与ZIF-8@QT按照质量比1 ∶2 ∶5混合,水浴超声30 min(200 W,40 kHz)。9 000 r/min,10 min,4 ℃离心,甲醇浸洗2次,去离子水浸洗2次,冻干得CMD-ZIF-8@QT。

1.4 仿生纳米载体的表征

1.4.1 用动态光散射系统(DLS)检测ZIF-8,ZIF-8@QT与CMD-ZIF-8@QT的粒径与Zeta电势 取空白ZIF-8,ZIF-8@QT与CMD-ZIF-8@QT的纳米颗粒溶液,适度稀释后,置于马尔文四通石英样品池中,采用DLS Zetasizer Nano-90测量样品的粒径和Zeta电势,每次测量重复3次。

1.4.2 用透射电镜(TEM)检测ZIF-8,ZIF-8@QT与CMD-ZIF-8@QT的结构 制备适宜浓度的ZIF-8、ZIF-8@QT和CMD-ZIF-8@QT的纳米粒溶液,分别取10 μl滴加在200目有碳支持膜的铜网上,常温放置2 h,干燥后用透射电子显微镜观察样品的结构。

1.4.3 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 将ZIF-8@QT、A549肺癌细胞膜与CMD-ZIF-8@QT按一定比例与上样缓冲液混合均匀,95 ℃加热5 min使蛋白变性。将样品和蛋白Marker按顺序依次缓慢加入到含有预先配置的凝胶加样孔中,进行电泳(先75 V 30 min,后100 V 60 min),电泳结束后,取出凝胶,用快速考马斯亮蓝染色液染色30 min,脱色2 h后,拍照并分析。

1.5 CMD-ZIF-8@QT的制剂学评价

1.5.1 标准曲线的制备 精密称取一定质量的槲皮素,用甲醇溶解配制成1 mg/ml的溶液,稀释成2.8,4.4,5.8,7.5,9,10.8 μg/ml的槲皮素标准工作液。用紫外分光光度计测定标准工作液在370 nm波长处的吸光度,并绘制标准曲线。

1.5.2 包封率与载药量的测定 按1.5.1所述方法制备出CMD-ZIF-8@QT,取二甲基咪唑1 940 mg,六水合硝酸锌25 mg,槲皮素的投药量分别为2.4,5.2,9.8,25.4,30.2,40.4,50.6 mg,将所得纳米粒离心(9 000 r/min,5 min),去除上清中未被包封的槲皮素。用紫外分光光度计测定上清溶液在371 nm波长处的吸光度,根据槲皮素溶液的标准曲线,计算出游离药物质量。按以下公式计算包封率(encapsulation efficiency,EE)和载药量(drug loading content,DLC):

EE(%)=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%

DLC(%)=(Wtotal-Wfree)/Ntotal

其中,Wtotal是系统中的药物总质量;Wfree是溶液中游离的药物质量,Ntotal是总纳米粒的质量。

1.5.3 酸响应释药分析 在pH 5.0与pH 7.4的PBS中研究CMD-ZIF-8@QT的释药性,将2 ml的ZIF-8@QT与CMD-ZIF-8@QT溶液装入3 500 D的透析袋中,每个透析袋放入装有30 ml释放介质的50 ml烧杯中,37 ℃摇床,100 r/min,在预定时间点1,2,5,10,15,20,30,60,80 h后,取出透析袋,用移液枪吸取1 ml释放液,并加入等体积的释放介质,采用上述紫外法测定QT的释放量,释放实验重复3次。

1.5.4 CMD-ZIF-8@QT的稳定性实验 将新制的CMD-ZIF-8@QT粒子,分别置于等体积的0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液和含有10% FBS的0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液中,在预定时间点0,6,12,18,24,36,48 h取出透析袋,用移液枪收集1 ml溶液,同时补入等量的释放介质,将收集的溶液用马尔文粒径仪检测粒径和电势,重复3次。

1.6 CMD-ZIF-8@QT的体内评价

1.6.1 CMD-ZIF-8@QT体内分布实验 在雄性BALB/c裸鼠右侧皮下注射100 μl(1×106个A549细胞)预冷的PBS溶液,待肿瘤长至200 mm3左右时,尾静脉注射Cy5与Cy5-CMD-ZIF-8并将其分为对照组和Cy5-CMD-ZIF-8组。分别于注射后1,6,12,24 h采用小动物活体成像仪测量肿瘤部位的荧光强度,观察结束后解剖小鼠取脏器和肿瘤,并测量各个脏器和肿瘤组织内的荧光强度,进行ROI半定量分析。

1.6.2 CMD-ZIF-8@QT在动物体内的药效实验 在4～5周龄的雄性BALB/c小鼠右侧皮下注射100 μl(1×106个A549细胞)预冷的PBS溶液。待肿瘤长至100 mm3左右时,将小鼠随机分为生理盐水组(saline)、QT组、ZIF-8@QT组与CMD-ZIF-8@QT组,每组5只。以5 mg/kg药物剂量尾静脉注射药物。每3 d给药1次,每2 d测量记录肿瘤的体积,每3 d记录裸鼠的体质量,第1次给药当天记为0 d,于第21天处死小鼠,取出脏器进行HE染色。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 仿生纳米载体的表征

2.1.1 动态光散射系统(DLS)检测结果 QT与CMD均带负电荷,ZIF-8因表面的Zn2+带正电荷,首先将药物QT包封进ZIF-8,结果显示,粒子的Zeta电势由正变负,同时粒径由(127.3 ±2.23)nm增长到(145.2 ±3.24)nm。将带负电荷的脂质类混合膜材料与ZIF-8@QT结合,结果显示,Zeta电势绝对值进一步增大,粒径由(145.2 ±3.21)nm增长到(176.4 ±2.72)nm。因此初步得出QT成功载入ZIF-8和CMD包封ZIF-8@QT粒子(见图1)。

2.1.2 透射电镜(TEM)结果 TEM结果表明,ZIF-8、ZIF-8@QT与CMD-ZIF-8的粒径结果分别为(85.3 ±3.22)nm,(96.2 ±2.73)nm,(109.3 ±3.71)nm。在纳米粒的整个制备过程中,纳米粒形貌由多面体形变为类球形,且纳米粒的粒径逐渐增大(见图2)。

2.1.3 SDS-PAGE 结果表明,ZIF-8作为金属有机骨架材料,在凝胶上不存在蛋白印迹;CMD存在完整的蛋白印迹;与CMD电泳条带相比,CMD-ZIF-8@QT的蛋白印迹位置大致相同,条带颜色相似(见图3),说明两者含有相同的蛋白成分,即癌细胞膜在制备和超声包覆的过程中,蛋白很好地保留下来。

图1 ZIF-8,ZIF-8@QT,CMD-ZIF-8@QT的表征图Figure 1 Characterization of ZIF-8,ZIF-8@QT, CMD-ZIF-8@QT

图2 ZIF-8,ZIF-8@QT与CMD-ZIF-8@QT的透射电镜形貌与粒径结果图Figure 2 Morphology and particle size of ZIF-8, ZIF-8@QT and CMD-ZIF-8@QT under transmission electron microscope

2.2 CMD-ZIF-8@QT的制剂学评价

2.2.1 标准曲线的制备 以QT浓度x对吸光度y

1.ZIF-8;2.CMD;3.CMD-ZIF-8@QT图3 SDS-PAGE的蛋白印迹结果Figure 3 SDS-PAGE of ZIF-8, CMD and CMD-ZIF-8@QT

作图,进行线性回归,得到标准曲线回归方程。回归方程为y=0.057 9x-0.011,R2=0.999,槲皮素的浓度在1～10 μg/ml的范围内线性关系良好(见图4)。

图4 QT的标准曲线Figure 4 Standard curve of QT

2.2.2 包封率与载药量的测定 结果表明,ZIF-8在加入低质量的QT时,具有较高的包封率和较低载药量,且随着QT质量的增加,包封率明显下降,载药量增加不明显。综合不同质量的QT对ZIF-8纳米粒包封率和载药量的影响,QT的加入量确定为15 mg,此时具有较高的包封率和载药量,包封率和载药量分别为84.2% ±1.42%和16.8% ±0.64%(见图5)。

图5 包封率与载药量随着QT的给药剂量变化趋势图Figure 5 Change trend of encapsulation efficient and drug loading content with the dose of QT

2.2.3 酸响应释药 结果表明,CMD-ZIF-8@QT在正常生理pH条件下是稳定的,在酸性的环境中,ZIF-8中的2-甲基咪唑和Zn2+之间的配位键会被破坏,导致ZIF-8裂解,从而实现药物的释放。在pH 5.0的条件下,孵育15 h,有高达88.6% ±1.6%的QT从CMD-ZIF-8@QT载体中释放出来,而在pH 7.4的条件下,15 h仅有8.1% ±2.3%的QT释放出来(见图6)。因此,得出仿生纳米载药系统CMD-ZIF-8@QT在正常生理条件下pH是稳定的,并具有良好的酸敏感性。

2.2.4 CMD-ZIF-8@QT的稳定性实验 采用pH 7.4 PBS溶液和含有10% FBS的pH 7.4 PBS溶液模拟体内正常生理环境,考察CMD-ZIF-8@QT在48 h内纳米粒的稳定性。结果表明,CMD-ZIF-8@QT在PBS溶液中48 h内能保持其稳定性,粒径小幅度增加,表明稳定性良好。在含有10% FBS的pH 7.4 PBS溶液,纳米载体由于FBS中含有一些蛋白质和无机物,粒径整体略大于在PBS溶液中的粒径(见图7)。因此,可知CMD-ZIF-8@QT纳米粒子在体内递送时具有一定的稳定性。

图6 CMD-ZIF-8@QT在pH 5.0与pH 7.4条件下的QT累积释放情况Figure 6 QT cumulative release of CMD-ZIF-8@QT under pH 5.0 and pH 7.4

图7 CMD-ZIF-8@QT在PBS和含10% FBS的PBS中的稳定性Figure 7 Stability of CMD-ZIF-8@QT in PBS and PBS containing 10% FBS

2.3 CMD-ZIF-8@QT的体内评价

2.3.1 CMD-ZIF-8@QT体内分布实验 结果表明,注射Cy5与Cy5-CMD-ZIF-8后,荧光大部分聚集于肝脏,与对照组相比,Cy5-CMD-ZIF-8组在肿瘤部位表现出较强的荧光,用小动物活体成像系统进一步ROI半定量分析,发现Cy5-CMD-ZIF-8组具有较好肿瘤组织靶向性和聚集性(P<0.01,见图8)。

2.3.2 CMD-ZIF-8@QT在动物体内的药效实验 结果表明,CMD-ZIF-8@QT组与QT组相比在体内抑制肿瘤效果方面差异有统计学意义(P<0.01),药物对肾脏无明显影响(见图9)。因此,得出构建了一种可以增强药物的抗肿瘤效果,并且对小鼠的肝肾无明显影响的药物递送系统。

B.Cy5-CMD-ZIF-8离体心、肝、脾、肺、肾与肿瘤的荧光分布 与对照组相比,* *P<0.01图8 CMD-ZIF-8在体内分布情况Figure 8 Distribution of CMD-ZIF-8 in vivo

图9 CMD-ZIF-8@QT的抗肿瘤作用Figure 9 Anti-tumor effect of CMD-ZIF-8@QT

3 讨论

最近,研究者从红细胞、免疫细胞、肿瘤细胞获取仿生材料进行纳米药物研究已成为研究热点,其中2种或2种以上细胞膜混合得到性能更优越的纳米靶向载体也开始成为研究方向。例如,Long等[17]构建的红细胞膜和癌细胞膜杂交后与酸敏感脂质体结合的复合递药系统,Hao等[18]利用靶向多肽修饰红细胞膜包裹ZIF-8等都是采用仿生材料作为递药系统的典型。但是,复杂的仿生递药系统不仅带来更多的不稳定性,也带来工艺复杂性和工业化生产成本高昂的弊端[19]。

在本研究的合成工艺中,纳米药物外层包裹混合膜材料后,粒子接近类球形,提高了纳米药物在体内的流动性,有利于载体药物在体内的递送。动物实验中,与其他组相比,CMD-ZIF-8@QT组抑瘤效果明显,并且治疗结束后,与对照组相比,CMD-ZIF-8@QT组肝肾的HE染色结果无明显差异,这表明癌细胞膜的修饰不仅增强了药物的肿瘤靶向性,显著抑制肿瘤生长,同时,药物CMD-ZIF-8@QT对肝肾功能均无明显损害,确保了仿生药物的用药安全性。另外,仿生药物能够有效抑制肿瘤体积,这也提示癌细胞表面可能保留了多种肿瘤相关抗原分子,当其被抗原呈递细胞摄取时,提高肿瘤的适应性免疫反应,最终抗肿瘤作用大大增强,其相关具体免疫机制有待进一步研究。

总之,本研究通过简单的工艺将癌细胞膜与DSPE混合制成混合膜修饰在ZIF-8@QT表面,成功制备出一种仿生纳米药物,其不但提高了QT的抗肿瘤效果,而且减小了药物对肝肾的毒副作用,使药物的安全性得到改善,也为药物的仿生化提供了参考依据。