裸鼠胆囊癌移植瘤血流灌注特征的超声造影研究

张炎晶,郝艳红,刘利平,苗 燕,刘静静,陈 娟,赵育芳(山西医科大学第一医院超声影像科,太原 0000;山西省肿瘤医院超声影像科;山西省人民医院超声科;通讯作者,E-mail:4656007@qq.com)

胆道系统恶性肿瘤危害大,其中以原发性胆囊癌最常见[1]。胆囊癌具有明确的发病危险因素[2],近年来其全球发病率呈明显上升趋势[3]。原发性胆囊癌起病隐匿,多数患者中晚期时才被临床诊断,因此预后较差[4],故胆囊癌的早期诊断对临床治疗方案及预后起着重要作用,加强胆囊癌基础研究对胆囊癌的早期诊断及治疗非常必要。本文通过建立裸鼠低分化胆囊癌皮下移植瘤模型,运用实时超声造影检查结合TIC定量分析软件,探讨胆囊癌皮下移植瘤超声造影血流灌注特征。

1 资料与方法

1.1 动物模型制备

随机选择2只裸鼠接种胆囊癌细胞株,在裸鼠肩胛区皮下接种0.2 ml浓度为1×107个/ml的GBC-SD细胞悬液,接种成功标准为结节存活且直径达5 mm,待成瘤后,麻醉裸鼠(经腹腔注射10%浓度水合氯醛),麻妥后剥离瘤体,选取瘤体边缘相对活力高的肿瘤细胞组织,使用眼科剪将这些细胞组织剪碎制备成体积约1 mm3的组织碎块,生理盐水清洗备用。

其余10只待实验裸鼠同法麻醉后脱毛以碘伏消毒肩胛区皮肤,以眼科剪在肩胛区剪开长约2～4 mm的小切口,切口周围皮下埋入2～3块备好的瘤体碎块,每只裸鼠左右侧各1个,共20个。术后于后腿部连续3 d青霉素肌肉注射,预防术后感染的发生,3 d后拆线。21 d建模成功。

1.2 仪器与方法

超声检查仪器为GE LOGIQ E9型高档彩色多普勒超声诊断仪,选用宽频线阵探头,探头频率6～15 MHz,机械指数MI固定于0.09,造影剂选用SonoVue白色冻干粉末,采用TIC定量分析软件。造影过程中各种造影条件设置固定。

10只裸鼠麻妥后合适体位固定于治疗台。先以常规超声扫查皮下移植瘤,选取肿瘤最大切面,分别测量其最大左右径(L)和前后径(W),计算瘤体体积(公式V=LW2/2)。启动造影模式,经裸鼠尾静脉团注超声造影剂0.1 ml/次,注射即刻开始计时,动态实时观察并存储图像,存储时间3 min。

1.3 图像分析

使用TIC分析软件,勾画ROI感兴趣区,其内瘤体的动态增强过程经软件自动绘制,生成TIC曲线,得到定量分析参数:到达时间(arrival time,AT)、达峰时间(time to peak,TTP)、峰值强度(peak intensity,PI)、曲线下面积(area under curve,AUC)等,以上操作均由两名高年资主治医师完成。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 常规超声

种植裸鼠胆囊癌皮下移植瘤共20例,最终造影成功模型16例,常规超声测量瘤体平均左右径(0.92 ±0.27)cm,前后径(0.67±0.18)cm,体积(0.25 ±0.22)cm3。瘤体边界尚清,呈圆形或椭圆形实性低回声结节,瘤体呈外生性及膨胀性生长,内部回声表现不一,可以均匀或不均匀,流体边缘与皮肤层分界清,超声检查中容易识别,注射造影剂后即刻CDFI可见瘤体内血流信号明显增多,小血管结构显示更清晰(见图1)。

图1 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤超声造影前后彩色多普勒血流图Figure 1 Color doppler flow images of subcutaneously transplanted tumors in nude mice of gallbladder carcinoma before and after contrast-enhanced ultrasound

2.2 病理表现

大体标本苍白、质地韧,部分瘤体中央可见坏死物呈乳糜样。HE染色显示肿瘤细胞特征与人胆囊癌相符,可见大量低分化深染巨核细胞,细胞排列致密、杂乱,胞质丰富、大小不一,肿瘤细胞核异型性明显(见图2)。

2.3 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤超声造影增强模式

裸鼠胆囊癌皮下移植瘤超声造影动脉早期显示为快速周边环状增强,动脉中晚期快速廓清,呈“快进快退”。依据达峰时瘤体中心部分是否能完全强化分为整体增强组及环状增强组。16例中5例表现为整体均匀增强,11例表现为瘤体周边环状增强,周边环状增强组瘤体中央均可见无增强区。5例整体增强组达峰后造影剂开始廓清呈整体低增强;11例环状增强组瘤体中心始终未见造影剂进入,达峰后周边环状增强部分开始廓清(见图3)。瘤体大小、体积在两组间无统计学差异(P>0.05,见表1)。

图2 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤病理Figure 2 Pathological changes of subcutaneously transplanted tumors in nude mice of gallbladder carcinoma

图3 整体均匀增强组及周边环状增强组超声造影Figure 3 Contrast-enhanced ultrasound of transplanted tumors in overall uniformly enhanced group and peripherally circularly enhanced group

表1 整体均匀增强组与周边环状增强组移植瘤大小、体积的比较

2.4 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型两种增强模式组超声造影各定量参数比较

应用TIC分析软件比较两组移植瘤CEUS各定量参数,结果显示整体增强组移植瘤PI及AUC明显高于环状增强组,差异有统计学意义(P<0.05),而AT和TTP两组间无统计学差异(见表2,图4)。

表2 整体均匀增强组与周边环状增强组定量参数比较

图4 整体均匀增强组及周边环状增强组超声造影时间强度曲线Figure 4 Time intensity curve of contrast-enhanced ultrasound in overall uniformly enhanced group and peripherally circularly enhanced group

3 讨论

原发性胆囊癌起病隐匿,早期诊断困难,多数患者中晚期才被临床诊断,恶性程度高,预后较差[4],超声检查是胆囊疾病首选的影像学方法,尽管常规超声能够正确诊断大多数胆囊疾病,但是由于常规超声难以显示胆囊病变的微小血管[5],对于部分胆囊息肉样病变良恶性的鉴别、厚壁型胆囊癌与慢性胆囊炎以及胆囊腺肌症的鉴别诊断仍存在困难,常规超声对早期胆囊癌的检出率仅23%[6]。

随着实时超声造影检查技术的飞速发展,其对肿瘤血流灌注能提供更多信息,超声造影实时检查能准确显现瘤体内血流灌注的时间顺序和微血管空间分布及差异,而良恶性肿瘤的血流灌注时间顺序和空间分布不同,因此超声造影技术可为病灶诊断与鉴别诊断提供基础;利用TIC曲线可获取超声造影的相关参数,通过瘤体内造影剂达峰时峰值强度、到达时间、达峰时间和曲线下面积等参数,可定量评价病灶血流灌注情况;超声造影结合TIC定量分析软件,能够获得肿瘤微循环的多种定量信息,其形态和参数变化在肿瘤定性诊断中发挥着重要作用[7],有效提高超声对胆囊病变良恶性诊断的准确率,对于鉴别胆囊炎、胆囊息肉、胆囊腺瘤、胆囊癌以及不活动的胆泥具有一定的诊断价值[8]。

本研究中裸鼠胆囊癌皮下移植瘤超声造影动脉早期可见快速环状增强,动脉中晚期快速廓清,呈典型的恶性肿瘤灌注模式“快进快退”,符合胆囊癌富血供的病理学特征。胆囊癌病理表现为有较丰富滋养血管,同时瘤体内可见大量动-静脉瘘,因此CEUS表现为“快进快退”的增强模式[9],与杨伟等[10]研究一致。

本组实验依据造影剂达峰时瘤体中心部分是否能完全增强将其分为整体强化组和环状强化组。对照病理结果,CEUS表现为整体均匀增强的瘤体其大体标本显示肿瘤呈质韧的苍白色,瘤体中央坏死组织很少或基本没有,HE镜下可见移植瘤细胞相对分布均匀,内部坏死区小或不明显;CEUS表现为周边环状增强的移植瘤切面可见中心为较多淡黄色乳糜样坏死,瘤体周边部为质韧苍白色组织,HE染色镜下见中心部正常细胞结构消失、可见核碎裂、细胞间质崩解,整体分布杂乱呈模糊的颗粒状及无定形的红染物。

超声造影时间-强度曲线获得的定量参数中AT为所观察的ROI内造影剂开始出现的时间;TTP为ROI内超声造影剂浓度达最高峰时所需时间,这个参数取决于ROI内的微循环血流灌注速度;PI与感兴趣区内的造影剂微泡浓度呈正比,微泡浓度又与病灶的血容量呈正比,因此反映了组织微血管密度;AUC反映的是ROI内观察期内的平均血流灌注量[11]。有报道人胆囊良恶性肿瘤超声造影增强特征差异主要集中在注射造影剂后1 min的时间段内[12],在预实验中显示裸鼠胆囊癌移植瘤超声造影增强也在注射造影剂后1 min内,注射造影剂1 min之后时间内的AUC对本实验研究意义不大。本研究中CEUS表现为整体均匀增强的瘤体PI值(反应ROI内微泡灌注最大浓度)、AUC(反应观察时间段内平均血流灌注量)平均值均明显高于周边环状增强的瘤体,两组间差异有统计学意义,说明在两种不同增强模式中整体均匀增强组瘤体内的血流灌注量更大,微泡灌注浓度更高。考虑其原因可能是周边环状增强瘤体内部出现坏死,其生长速度较整体均匀增强瘤体快,瘤体内部张力高(本研究中两组瘤体大小并没有统计学差异),周边肿瘤细胞受挤压分布较紧密,阻碍滋养血管形成,滋养血管形成较少,因此峰值强度低,AUC低[13]。

综上所述,裸鼠胆囊癌皮下移植瘤超声造影检查时可分为两种“快进快出”的强化模式,与大体病理相对应,超声造影定量分析可评价裸鼠胆囊癌血流灌注信息,并可更精确反映两种增强类型的差异。