盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮对链脲佐菌素和高脂饮食诱导的大鼠血脂和胰岛素抵抗的影响

钱 振,田小溪,校建波,王 琦,黄 潭,王继鹏,王佳宁,张明明,李海荣(中国人民解放军空军军医大学第二附属医院急诊科,西安 7003;中国人民解放军空军军医大学第二附属医院心内科;通讯作者,E-mail:37666@qq.com)

目前,肥胖问题已成为一项制约社会和经济发展的公共卫生问题,对社会和家庭带来了较大的经济和身体负担[1]。医学专家统计发现,肥胖人群比例的增加与多种疾病如代谢综合征、糖尿病、高血脂、高血压等的发病率升高具有明显的相关性[2]。代谢综合征是一种包括糖类代谢紊乱、血脂代谢紊乱、高血压等疾病的症候群,并且与心脑血管疾病的发生密切相关[3,4]。目前的研究报道胰岛素的抵抗是导致代谢综合征发生的重要原因之一[5]。

盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride,MH)是一种双胍类降糖药,目前已经作为胰岛素增敏剂广泛应用于糖尿病的治疗中,并且表现出较好的改善胰岛素抵抗和降血糖的作用[6]。此外,还有研究报道盐酸二甲双胍具有控制体质量、降低心脑血管并发症的作用。清痰化瘀饮是一种由黄芪、决明子、法半夏、茯苓等多种中药材混合熬制的一味中药[7]。研究发现,清痰化瘀饮具有改善血脂和血糖代谢、保护血管内皮、抑制血管平滑肌增生等多种作用,并且在治疗动脉粥样硬化、高血压方面疗效显著[8]。

目前,中西医结合在治疗高血糖、高血脂等代谢性疾病方面取得了良好的效果。由于盐酸二甲双胍是一种胰岛素增敏剂,而清痰化瘀饮同时具有降压、降糖、改善平滑肌功能,因此,本研究推测盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮可能对糖脂代谢具有协同作用。然而,目前尚不清楚盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮在血脂调节和胰岛素抵抗方面的作用。因此,本研究通过链脲佐菌素(STZ)和高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗,并探讨了盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮对大鼠血脂和胰岛素抵抗的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物和试剂 盐酸二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司(国药准字H20023371)。清痰化瘀饮为本院自制,清痰化瘀饮配方如下:黄芪30 g,决明子30 g,法半夏15 g,茯苓15 g,泽泻15 g,苍术15 g,白术15 g,砂仁15 g,山药15 g,薏苡仁15 g,生山植30 g,桃仁12 g,红花12 g,川穹9 g,甘草6 g。将药材放入含有1 000 ml水的砂锅中,然后常规煎煮,并浓缩蒸干,称重后溶于100 ml蒸馏水中制备清痰化瘀饮浸膏。标准大鼠饲料购自武汉华联科生物技术有限公司,饲料中的蛋白质、脂肪和碳水化合物的占比依次为25%,15%和60%。高脂饲料由标准饲料中加入胆固醇、猪油、白糖制备而成,该高脂饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司,高脂饲料中的蛋白质、脂肪和碳水化合物的占比依次为20%,60%和20%。

链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司。血清低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)ELISA试剂盒检测购自上海纪宁生物科技有限公司。大鼠胰岛素(INS)检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司。血清瘦素ELISA检测试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。苏木精和伊红(HE)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。RIPA裂解缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司。BCA蛋白质测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。葡萄糖转运蛋白(GLUT-4)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)和CAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Abcam公司。

1.1.2 实验动物 100只6周龄无特定病原体级(SPF级)雄性SD大鼠购自西安交通大学实验动物中心[许可证号:SYXK(陕)2018-001],体质量205～225 g,将大鼠饲养在(25 ±3)℃温度、50%～60%相对湿度、12 h光照黑暗交替的环境中,饲养期间提供本实验室自制的纯净水和相应的大鼠饲料。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及处理 将100只SD大鼠随机分为对照组、模型组、盐酸二甲双胍组、清痰化瘀饮组、盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组,每组20只大鼠。除对照组之外,其他组大鼠均经尾静脉注射一次性小剂量STZ造成胰岛β细胞损伤。对照组大鼠喂养标准饲料,其他组喂养高脂饲料。喂养45 d后一次性经尾静脉注射小剂量STZ(15 mg/kg),然后分别对各组大鼠进行糖耐量检查。糖耐量检查方法如下:首先将大鼠过夜禁食不禁水14～16 h,然后尾静脉取血并测定空腹血糖,然后以2 g/kg体质量的剂量灌胃20%的葡萄糖液,2 h后检测尾静脉血血糖值,将糖耐量异常(空腹血糖<7.0 mmol/L但高于4.0 mmol/L)的大鼠用于后续实验。购买的20只对照大鼠中,有1只大鼠足部划伤出血,1只大鼠口腔出血,3只大鼠活动性低、毛色暗淡、体质量明显低于其他大鼠,因此剔除。80只建模的大鼠中3只死亡,63只建模成功,3只建模成功的大鼠进食少,体质量明显低于其他大鼠,因此剔除。最终,对照组纳入15只大鼠,60只建模成功的大鼠随机分为4组,每组15只。盐酸二甲双胍组的大鼠每天按照160 mg/kg的剂量灌胃给予盐酸二甲双胍溶液,清痰化瘀饮组的大鼠每天按照500 mg/kg的剂量灌胃给予清痰化瘀饮浸膏。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠每天分别按照160 mg/kg和500 mg/kg的剂量同时灌胃给予盐酸二甲双胍溶液和清痰化瘀饮浸膏。正常组和模型组的大鼠灌胃给予等体积的生理盐水。共治疗8周。

1.2.2 生化指标分析 治疗完成后,大鼠禁食12 h,腹腔注射50 mg/kg的戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司)麻醉大鼠,取2 ml腹主动脉血加入抗凝管中,采用全自动生化分析仪检测各组大鼠空腹血糖(FPG)、血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)。其余血液于3 000 r/min离心15 min,取上清,-80 ℃分装保存。血清LDL、HDL和瘦素采用ELISA试剂盒检测。血清胰岛素(INS)采用大鼠INS检测试剂盒检测。

1.2.3 血清氧化应激指标检测 取2 ml大鼠腹主动脉血加入抗凝管中,3 000 r/min离心15 min,取上清分装,-80 ℃保存。血清SOD、GSH-Px和MDA严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.4 血清炎症因子的检测 血清TNF-α、IL-1和IL-6均采用ELISA检测试剂盒测定。

1.2.5 苏木精和伊红(HE)染色 实验结束后处死大鼠并迅速分离胰腺组织,然后使用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,用切片机切成5 μm厚的切片,然后用常规的HE染色试剂盒进行染色,光学显微镜观察胰岛形态。

1.2.6 蛋白质印迹分析胰腺组织中GLUT-4的蛋白表达 将各组大鼠胰腺组织分离,剪碎,加入含有PMSF(1 mmol/L)的RIPA裂解缓冲液中裂解并均质化。将裂解物在4 ℃下以15 000 r/min离心15 min,转移上清液至新的离心管。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白质。然后将蛋白质加载到10%SDS-PAGE上电泳并转移到PVDF膜上,5% BSA封闭膜1 h,将膜与抗GLUT-4(1 ∶1 000)、IRS-1(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶1 000)的一抗一起4 ℃过夜孵育。然后将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h,通过增强化学发光法(ECL)进行显影。将蛋白质水平标准化为GAPDH。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 二甲双胍和清痰化瘀饮对大鼠血糖的影响

结果显示,模型组大鼠的空腹血糖水平显著高于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠的空腹血糖水平显著低于模型组(P<0.05)。此外,盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的空腹血糖水平显著低于清痰化瘀饮组(P<0.05,见图1)。

2.2 二甲双胍和清痰化瘀饮对大鼠血脂的影响

结果显示,模型组大鼠的血清TC、TG和LDL水平显著高于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠的TC、TG和LDL水平显著低于模型组(P<0.05)。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的TC、TG和LDL水平显著低于盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组(P<0.05)。模型组大鼠的HDL水平显著低于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠的HDL水平显著高于模型组(P<0.05)。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的HDL水平显著高于盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组(P<0.05,见表1)。

2.3 二甲双胍和清痰化瘀饮对大鼠胰岛素抵抗的影响

模型组大鼠的血清胰岛素(INS)和瘦素水平显著高于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠的INS和瘦素水平显著低于模型组(P<0.05)。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的INS和瘦素水平显著低于盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组(P<0.05,见表2)。

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与盐酸二甲双胍组比较,&P<0.05;与清痰化瘀饮组比较,△P<0.05图1 各组大鼠的空腹血糖(FPG)水平Figure 1 Fasting blood glucose level of rats in each group

表1 各组大鼠的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平 (mmol/L)

表2 各组大鼠的胰岛素和瘦素水平

2.4 二甲双胍和清痰化瘀饮对大鼠氧化应激指标的影响

模型组大鼠的血清SOD和GSH-Px水平显著低于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠的SOD和GSH-Px水平显著高于模型组(P<0.05)。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的SOD和GSH-Px水平显著高于盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组(P<0.05,见表3)。

模型组大鼠的血清膜质过氧化指标(MDA)水平显著高于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠MDA水平显著低于模型组(P<0.05)。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的MDA水平显著低于盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组(P<0.05,见表3)。

2.5 二甲双胍和清痰化瘀饮对大鼠炎症因子的影响

模型组大鼠的血清炎症因子TNF-α,IL-1和IL-6水平显著高于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠的TNF-α、IL-1和IL-6水平显著低于模型组(P<0.05)。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的TNF-α、IL-1和IL-6水平显著低于盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组(P<0.05,见表4)。

表3 各组大鼠的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平

表4 各组大鼠的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素水平 (μg/L)

2.6 二甲双胍和清痰化瘀饮对大鼠胰腺组织葡萄糖转运蛋白(GLUT-4)和胰岛素受体底物-1(IRS-1)表达的影响

模型组大鼠的胰腺组织GLUT-4和IRS-1蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组大鼠的GLUT-4和IRS-1蛋白表达水平显著高于模型组(P<0.05)。盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的GLUT-4和IRS-1蛋白表达水平显著高于盐酸二甲双胍组和清痰化瘀饮组(P<0.05,见图2)。

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与盐酸二甲双胍组比较,&P<0.05;与清痰化瘀饮组比较,△P<0.05图2 各组大鼠的葡萄糖转运蛋白-4(GLUT-4)和胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白表达水平Figure 2 Glucose transporter-4(GLUT-4) and insulin receptor substrate-1(IRS-1) protein expression levels of rats in each group

2.7 二甲双胍和清痰化瘀饮对大鼠胰腺组织的影响

各组大鼠胰腺组织的HE染色结果显示,对照组大鼠胰岛呈球形团状,边界清晰,结构完整。模型组大鼠中胰岛形态发生较大变化,结构混乱,边界不清晰,并且细胞发生固缩并形成空泡,脂肪浸润明显。盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮治疗组大鼠的胰岛形态明显改善,结构较完整,边界变清晰,空泡减少,脂滴沉积明显减少。并且,盐酸二甲双胍+清痰化瘀饮组大鼠的胰腺组织病变程度明显低于单药治疗(见图3)。

黑色箭头:胰岛细胞;红色箭头:细胞空泡化、脂滴沉积;蓝色箭头:胰岛边界图3 各组大鼠的胰腺组织H&E染色 (×200)Figure 3 H&E staining of pancreas tissue of rats in each group (×200)

3 讨论

目前,虽然在全球范围内的某些贫困国家和地区生活的人群体质量仍然过低,然而,在大多数国家,肥胖累及人群的数量要远多于营养不良。肥胖是代谢综合征的主要危险因素之一[9,10],代谢综合征的发生增加了心脑血管疾病的发生风险[3,4]。目前的研究报道胰岛素的抵抗是导致代谢综合征发生的重要原因,而肥胖是引起胰岛素抵抗的独立危险因素。因此,开发可用于防治代谢综合征、糖尿病、高血脂等疾病的药物具有重大意义。

本研究通过STZ联合高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗,并探讨了盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮对大鼠血脂和胰岛素抵抗的影响及可能机制。盐酸二甲双胍是一种双胍类降糖药,其机制与抑制游离脂肪酸从脂肪细胞中释放并抑制肝糖原合成有关。目前盐酸二甲双胍已经作为胰岛素增敏剂广泛应用于糖尿病的治疗中,并且表现出较好的改善胰岛素抵抗的作用。此外,还有研究报道盐酸二甲双胍还具有控制体质量、改善内皮功能、降低心脑血管并发症的作用[6]。

清痰化瘀饮是由多种中药材混合熬制的一味中药,包括黄芪、决明子、法半夏、茯苓、泽泻、苍术、白术、砂仁、山药、薏苡仁、生山植、桃仁、红花、川穹、甘草等。上述中草药均具有多种生物活性,并且大多数药材在我国有悠久的应用历史,已经作为多种疾病的治疗药物广泛应用,主要功效包括抗菌、抗炎、降血压、降血脂等。例如:黄芪具有止咳平喘、消炎祛痰、补气健脾的功效。法半夏具有化痰消痞作用。生山楂健脾消食、降脂化浊。桃仁可活血祛瘀。红花散瘀止痛、活血通经。川芎祛风止痛、补气活血。其他文献报道,清痰化瘀饮具有改善血脂和血糖代谢、保护血管内皮、抑制血管平滑肌增生等多种作用,并且在治疗动脉粥样硬化、高血压方面疗效显著[7,8]。然而,目前尚不清楚盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮在血脂调节和胰岛素抵抗方面的作用。本研究发现盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮均可有效降低大鼠的空腹血糖水平,此外,两种药物还可有效降低TC、TG和LDL水平,并且升高HDL水平。说明盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮均具有降血糖和降血脂的作用。此外,本研究发现盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮对血糖和血脂指标的改善作用明显好于单药治疗。

本研究发现盐酸二甲双胍联合清痰化瘀饮在降低胰岛素方面的作用明显好于单药治疗,说明该药物组合更有助于提高胰岛素敏感性。瘦素是一种脂肪组织的特异性分泌蛋白,可控制全身脂肪、葡萄糖代谢,并调节胰岛功能[11]。当机体脂肪含量升高时,瘦素的水平也会迅速增加,并导致胰岛素抵抗。本研究发现盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮联合用药对瘦素的抑制作用明显好于单药治疗。提示两种药物在降血糖、降血脂和提高胰岛素敏感性方面的作用可能与调节瘦素合成和分泌有关。

代谢综合征的发生涉及氧化应激。大量研究证实,机体内产生大量自由基时可导致胰岛β细胞凋亡并增加胰岛素抵抗性。SOD和GSH-Px是两种重要的抗氧化酶,SOD具有清除超氧阴离子的能力,可将其转化为毒性较小的过氧化氢,而GSH-Px可进一步将过氧化物转化生成水,从而降低氧化应激损伤。MDA是膜脂质过氧化反应产物。本研究显示盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮联合用药可将SOD、GSH-Px和MDA水平恢复至与正常大鼠无显著差异的水平。说明两种药物改善胰岛素抵抗的作用与降低氧化应激损伤有关。

糖尿病、高血脂、高血糖的发生与免疫功能紊乱密切相关,大量文献证实上述病变发生时机体内炎症反应加剧。TNF-α、IL-1和IL-6均是重要的促炎细胞因子。有研究报道,IL-1和IL-6可过度激活杀伤性T淋巴细胞,从而引起胰岛β细胞死亡[12]。TNF-α可抑制葡萄糖转运蛋白(GLUT-4),从而诱发胰岛素抵抗。本研究显示模型组大鼠的TNF-α、IL-1和IL-6水平显著升高,而盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮联合用药对上述炎症因子的抑制作用明显好于单药治疗。说明两种药物的降血脂和提高胰岛素敏感性的作用可能通过抑制炎症反应来实现。

葡萄糖转运蛋白(GLUT-4)是促进葡萄糖转运的跨膜蛋白,与胰岛素抵抗密切相关,GLUT4可通过与胰岛素结合实现葡萄糖的转运,GLUT4被抑制可直接导致糖代谢异常[13]。胰岛素受体底物-1(IRS-1)是胰岛素受体酪氨酸激酶的底物[14]。当胰岛素与其受体结合时可导致胰岛素受体酪氨酸激酶和IRS-1的磷酸化,然后与P13K的P85亚基结合并激活P13-2K,继而激活Akt或PKB,从而促进GLUT4转位至细胞膜并进行葡萄糖转运。因此,IRS-1和GLUT-4的抑制均可引起高血糖和胰岛素抵抗。本研究发现模型组大鼠的GLUT-4和IRS-1表达被抑制,而盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮联合用药显著上调了GLUT-4和IRS-1的蛋白表达,说明两种药物可通过上调GLUT-4和IRS-1的表达来发挥降血糖和提高胰岛素敏感性的作用。

综上所述,盐酸二甲双胍和清痰化瘀饮均具有较好的降血糖、降血脂和提高胰岛素敏感性的作用。但与单独给药相比,两种药物联用的效果更好。其机制与药物对氧化应激损伤和炎症因子表达的抑制,及其胰腺组织GLUT-4和IRS-1的表达上调有关。