lncRNA PURPL通过调控miR-367-3p/MTA3轴抑制肾癌细胞的增殖和侵袭

杨凌博，孙建涛，鲁帅奇，武新超，李小辉

肾癌的发病率在泌尿生殖系统肿瘤中位居第2位，是常见的肾脏恶性肿瘤[1]。早期肾癌的治疗取得较大进展，然而中晚期肾癌的疗效依然较差，肾癌细胞高度增殖活性及侵袭导致中晚期肾癌患者预后不良[2-3]。目前，肾癌增殖和侵袭的机制尚不清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)由RNA聚合酶Ⅱ转录合成，在肾癌、胃癌等恶性肿瘤的发生、发展中起决定性作用[4-5]。PURPL是新近发现的lncRNA，参与调控肝癌、胃癌、结直肠癌等肿瘤细胞的增殖和转移，其表达高低与肿瘤的大小和组织学分级相关[6-8]。PURPL在肾癌组织中的表达水平、具体作用及调控机制尚待阐明。本文旨在探讨PURPL在肾癌组织和细胞系中的表达，明确PURPL通过调控miR-367-3p/MTA3分子轴对肾癌细胞增殖和侵袭的影响，为寻找新的肾癌治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床资料 收集2018年1月～2020年8月我院泌尿外科手术切除的67例肾癌组织，均为肾透明细胞癌。其中男性39例，女性28例；年龄26～83岁，平均63.23岁。根据2010年美国癌症联合会TNM分期标准：Ⅰ期43例，Ⅱ期23例；根据Fuhrman组织学分级：Ⅰ级23例，Ⅱ级29例，Ⅲ级9例，Ⅳ级6例。另收集距离肿瘤边缘>2 cm的癌旁组织作为对照。肿瘤组织和癌旁组织均经两名以上病理医师证实，标本均冻存于液氮，患者术前均无放、化疗及免疫治疗史。本实验经我院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.1.2细胞与试剂 肾癌细胞系和正常肾小管上皮细胞，购于中国典型培养物保藏中心。阴性对照慢病毒、PURPL慢病毒、miR-367-3p mimic、miR-NC mimic、PURPL野生型报告基因(PURPL-WT)与突变型报告基因(PURPL-MUT)，均购于上海吉玛公司。TRIzol试剂和Lipofectamine 2000，购于美国Invitrogen公司。MTT试剂盒购于南京凯基公司。qRT-PCR试剂盒和引物，购于南京建成生物研究所。胎牛血清、DMEM培养基、RPMI 1640培养基，购于美国Hyclone公司。双荧光素酶报告基因试剂盒，购于美国Promega公司。一抗(MTA3、Cyclin A、CDK2、Zeb-2、GAPDH、Snail)和辣根过氧化物酶标记二抗，购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与转染 ACHN、786-O、A498、Caki-1、OS-RC-2细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，HK-2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，常规培养于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。OS-RC-2细胞进入对数生长期后，胰酶消化并接种到6孔板，实验分组：对照组和PURPL组分别感染阴性对照慢病毒和PURPL慢病毒，感染复数(MOI)均为40；感染48 h后进行后续实验。

1.2.2qRT-PCR检测PURPL、miR-367-3p与MTA3 mRNA的表达 采用TRIzol试剂提取组织及细胞总RNA，逆转录合成cDNA。根据qRT-PCR试剂盒说明书建立反应体系，以GAPDH和U6作为内参照。qRT-PCR检测PURPL正向引物：5’-TTCTACCGCAATTCGATGGAGTCTTG-3’，反向引物：5’-GAGGCAGGAGAATGGCGTGA-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-367-3p正向引物：5’-CGAGCAATTGCACTTTAGCAAT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH正向引物：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，反向引物：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’；MTA3正向引物：5’-TCCTCCAGCAACCCATACCT-3’，反向引物：5’-TCGGTCAAGTCAGCCTCAAC-3’。qRT-PCR运行参数：95 ℃ 50 s，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，合计35个循环。采用2-ΔΔCt方法计算PURPL、miR-367-3p和MTA3 mRNA表达水平。

1.2.3MTT法检测OS-RC-2细胞活力 收集对数生长期的OS-RC-2细胞，调整细胞密度至每毫升1×104个细胞，取150 μL细胞悬液加入96孔板。取20 μL MTT试剂加入每孔，培养箱内培养4 h。吸去培养基后，取120 μL二甲基亚砜加入各孔，利用振荡器充分振荡。利用酶标仪在波长450 nm处测量每孔光密度(OD)值。每天检测OS-RC-2细胞活力，连续检测5天。

1.2.4Transwell实验检测OS-RC-2细胞侵袭 在Transwell小室预铺基质胶，用不含胎牛血清的培养基调整对数生长期的OS-RC-2细胞密度至每毫升1×105个细胞，取150 μL细胞悬液加入Transwell小室，取550 μL含胎牛血清的培养基加入下室。培养24 h，取出Transwell小室并用棉签擦去未穿过上室的细胞，利用甲醇进行固定，利用结晶紫染液进行染色，流水清洗并晾干，显微镜(×100)下观察、拍照、计数。

1.2.5生物信息学技术预测和双荧光素酶报告基因实验验证PURPL的潜在分子机制 利用starBase v 2.0数据库预测PURPL结合的miRNA。收集对数生长期的OS-RC-2细胞接种至96孔板，根据Lipofectamine 2000说明书进行转染，将PURPL-WT与PURPL-MUT及miR-367-3p mimic或miR-NC mimic共转染至OS-RC-2细胞中，转染48 h后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测OS-RC-2细胞的相对荧光素酶活性。

1.2.6Western blot法检测MTA3蛋白表达 收集对数生长期的OS-RC-2细胞，利用RIPA裂解液提取总蛋白。BCA法检测蛋白浓度后，在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至硝酸纤维素膜。在5%脱脂牛奶中封闭，加入一抗(稀释比均为1 ∶1 000)在4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育3 h，配置ECL试剂，在凝胶成像系统中曝光、显影。

2 结果

2.1 肾癌和癌旁组织中PURPL的表达水平PURPL在肾癌和癌旁组织中表达分别为0.40±0.14和1.61±0.21，癌旁组织的PURPL表达是肾癌组织的4.03倍，明显高于肾癌组织(P<0.01，图1)。

图1 肾癌组织和癌旁组织中PURPL表达水平

2.2 肾癌细胞和正常肾小管上皮细胞中PURPL表达水平肾癌ACHN、786-O、A498、Caki-1、OS-RC-2细胞中PURPL的表达分别为0.53±0.08、0.66±0.06、0.41±0.03、0.77±0.05、0.13±0.03，明显低于正常肾小管上皮细胞HK-2(1.00±0.05)，差异有统计学意义(P均<0.05，图2)，OS-RC-2细胞中PURPL表达水平最低(P<0.01)，故选择OS-RC-2细胞进行后续实验。

图2 肾癌细胞和正常肾小管上皮细胞中PURPL表达水平

2.3 对照组和PURPL组OS-RC-2细胞中PURPL的表达水平荧光显微镜显示慢病毒感染成功。qRT-PCR结果显示，PURPL组和对照组OS-RC-2细胞中PURPL表达分别为16.26±3.10和1.02±0.12，差异有统计学意义(P<0.01，图3)，表明PURPL过表达成功。

图3 OS-RC-2细胞中PURPL的表达水平：A.对照组(普通显微镜)；B.PURPL组(普通显微镜)；C.对照组(荧光显微镜)；D.PURPL组(荧光显微镜)

2.4 过表达PURPL对OS-RC-2细胞增殖活力的影响MTT法结果显示，48 h后PURPL组OS-RC-2细胞增殖活力明显低于对照组(P<0.05，图4)。

图4 MTT检测PURPL对OS-RC-2细胞增殖活力的影响

2.5 过表达PURPL对OS-RC-2细胞侵袭的影响Transwell实验显示，对照组和PURPL组OS-RC-2细胞侵袭数分别为(71.53±6.23)个和(26.87±3.88)个；与对照组相比，过表达PURPL可明显抑制OS-RC-2细胞侵袭(P<0.01，图5)。

图5 Transwell实验检测PURPL对OS-RC-2细胞侵袭能力的影响：A.Transwell实验检测PURPL对肾癌细胞侵袭的影响；B.细胞侵袭数的半定量分析

2.6 生物信息学技术预测及双荧光素酶报告基因实验验证PURPL的潜在机制利用starBase v2.0数据库预测miR-367-3p可能是PURPL的靶基因(图6)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，通过共转染miR-367-3p mimic和靶向位点无突变的PURPL-WT载体使OS-RC-2细胞中荧光素酶活性明显下降(P<0.01)，而共转染miR-367-3p mimic和靶向位点突变的PURPL-MUT载体对荧光素酶活性无显著作用(P>0.05，图7)，提示miR-367-3p是PURPL的靶基因。

图6 生物信息学技术预测PURPL的潜在机制

图7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-367-3p和PURPL的靶向关系

2.7 过表达PURPL的OS-RC-2细胞中miR-367-3p和MTA3 mRNA表达变化qRT-PCR检测显示，对照组和PURPL组OS-RC-2细胞miR-367-3p的表达分别为1.04±0.16和0.23±0.08，过表达PURPL显著下调miR-367-3p的表达(P<0.01)。对照组和PURPL组OS-RC-2细胞MTA3 mRNA的表达分别为1.01 ± 0.06和5.49 ± 1.16，过表达PURPL显著上调MTA3 mRNA的表达(P<0.01)。

2.8 过表达PURPL促进MTA3蛋白表达Western blot结果显示，过表达PURPL后OS-RC-2细胞中MTA3蛋白表达明显增加，细胞增殖蛋白如Cyclin A、CDK2表达明显降低，细胞侵袭蛋白如Zeb-2、Snail表达明显降低，提示OS-RC-2细胞的增殖和侵袭能力明显降低(图8)。

图8 Western blot法检测MTA3蛋白及细胞功能蛋白的表达：A.Western blot实验；B.蛋白表达灰度值分析

3 讨论

lncRNA参与调控染色质修饰、转录抑制及激活、核内运输等途径，影响基因的表达[9]。随着测序技术的进步，lncRNA已成为肾癌研究领域的新热点[10]。最新文献报道，lncRNA是肾癌增殖和转移过程的关键调控因子[11-12]。Cai等[13]研究表明，lncRNA PCGEM1主要位于细胞质，其在肾癌细胞中表达升高，沉默lncRNA PCGEM1可抑制肾癌的细胞增殖和迁移，miR-433-3p是lncRNA PCGEM1的靶基因。Hu等[14]研究表明，MSC-AS1在肾癌组织中显著上调，与肾癌患者的预后不良相关，降低MSC-AS1表达可通过促进miR-3924表达抑制肾癌细胞的增殖和迁移特性。lncRNA在不同肿瘤细胞中表现为不同的表达模式，因此在不同肿瘤细胞中的作用不同[15]。研究发现，PURPL能够显著调控结直肠癌细胞的增殖和转移能力[8]。目前，PURPL在肾癌中的表达、功能及调控机制尚不清楚。本组发现在肾癌组织和细胞系中PURPL的表达明显下调，上调PURPL能够抑制肾癌细胞的增殖和侵袭，提示PURPL在肾癌细胞中发挥抑癌功能。

lncRNA可特异性与相应miRNA互补结合，发挥“分子海绵”作用，抑制miRNA对其靶基因的调控作用[16-17]。本组采用starBase v2.0预测显示，PURPL与miR-367-3p存在潜在的结合位点。双荧光素酶报告基因实验验证PURPL共价靶向miR-367-3p。最近研究表明，miR-367-3p在非小细胞癌、骨肉瘤、肾透明细胞癌等多种肿瘤中高表达，显著促进肿瘤细胞生长和转移，发挥明显的癌基因功能[18-19]。miR-367-3p在肾癌组织和细胞系中表达增加，下调miR-367-3p显著抑制肾癌细胞的增殖和转移，MTA3基因是miR-367-3p在肾癌中的直接靶基因[20]。qRT-PCR和Western blot结果显示，上调PURPL可显著抑制miR-367-3p的表达，miR-367-3p表达下调可显著促进MTA3基因的表达。以上实验结果表明，PURPL可能作为miR-367-3p的“分子海绵”调节MTA3基因的表达，进而调控肾癌的发生、发展。Western blot结果显示，上调PURPL后细胞增殖蛋白如Cyclin A、CDK2表达显著减少，细胞侵袭蛋白如Zeb-2、Snail表达显著减少，提示OS-RC-2细胞增殖和侵袭能力明显降低。PURPL在体内对肾癌细胞增殖和侵袭的影响尚不明确，本课题组下一步将通过动物实验对PURPL在体内的作用进行验证。

综上所述，lncRNA PURPL在肾癌组织和细胞系中表达下调，PURPL通过下调miR-367-3p促使MTA3表达上调，从而抑制肾癌OS-RC-2细胞的增殖和侵袭。PURPL/miR-367-3p/MTA3轴有望成为肾癌治疗的标志物和有效靶点。