组蛋白H3K27M诱发弥漫中线胶质瘤的发病机制

姚晶晶，孟轶婷，李 莉，尹洪芳

表观遗传学通过DNA甲基化、染色质组蛋白尾修饰、小RNA (microRNA, miRNA) 等方式，影响特异性转录因子与其靶基因结合，引起基因改变[1]。WHO(2016)中枢神经系统提出组蛋白H3K27M突变型的弥漫中线胶质瘤，并认为无论肿瘤的组织学分级，其都应被视为WHO Ⅳ级的高级别胶质瘤。前期研究多认为，组蛋白H3K27M突变是关键的致瘤因素，然而肿瘤的自然进程和细胞培养显示，组蛋白H3K27M突变只是驱动因素[2-3]，其他相关因素成为目前研究热点。

1 弥漫性中线胶质瘤

WHO(2016)中枢神经系统提出伴H3K27M突变的弥漫中线胶质瘤是一种新的肿瘤类型，这也是WHO首次将基因改变与组织学改变联合作为肿瘤名称。弥漫中线胶质瘤主要见于中线部位，包括脑干、丘脑和脊髓，也可见于第三脑室、下丘脑、松果体和小脑。肿瘤细胞以星形细胞分化为主，可以是WHO Ⅱ～Ⅳ级中的任何一种形态；且无论哪种组织学分级，预后均类似于WHO Ⅳ级胶质瘤[4]。虽然H3K27M突变也可见于其他肿瘤，如低级别胶质瘤伴毛细胞样特征、多形性黄色瘤样星形细胞瘤、中间分化的松果体实质细胞瘤、室管膜下瘤、节细胞胶质瘤、弥漫性软脑膜胶质神经元肿瘤，但都不能归为经典的弥漫中线胶质瘤[5]。

2 组蛋白H3及其突变类型

H3K27是指组蛋白H3上第27位赖氨酸。组蛋白是染色体的基本结构蛋白，DNA缠绕包裹4种核心组蛋白异二聚体组成的八聚体进而形成核小体。4种核心组蛋白分别是H2A、H2B、H3、H4，其中H3又分为2种经典型(H3.1和H3.2)，6种亚型分别是：H3.3、CENP-A(centromere protein A)、H3.X、H3.Y、H3.1T和H3.5[6]。经典型组蛋白构成组蛋白的主体，在DNA复制的S期表达，而组蛋白亚型在整个细胞周期中表达[7]。因此，H3.1和H3.2只能在DNA复制期整合到染色质中；而在非分裂细胞中，H3.3持续存在并替代H3.1及H3.2[8]。H3K27M突变是指H3体细胞突变，导致第27位赖氨酸被甲硫氨酸替代。H3K27M突变包括H3.1K27M、H3.2K27M、H3.3K27M，3种类型均可产生H3K27M蛋白，其中以H3.3K27M突变最常见[9]。

3 组蛋白H3K27甲基化及其相关因素

H3K27尾部可以发生单甲基化(H3K27me1)、双甲基(H3K27me2)、三甲基(H3K27me3)及乙酰化(H3K27ac)等修饰[6]。不同程度的K27甲基化均由多梳抑制复合物2(polycomb-repressive complex 2, PRC2)催化，它是唯一一个明确的H3K27甲基化转移酶[10]，也是多梳蛋白家族(polycomb group, PcG)中的一员[11]，与PRC1一起，维持基因抑制[12]。PRC2有3个核心成分：EZH1(enhancer of zeste homolog 1)或EZH2、SUZ12(suppressor of zeste)和EED(embryonic ectoderm development)[13]，其中EZH1和EZH2不能同时存在，两者互相排斥并相互替代[14]。通过EZH2的SET结构域，将S-腺苷基甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)的甲基转移到H3K27尾上，实现单、双、三甲基化[15-16]。在正常细胞中，孤立的EZH1/2催化性SET结构域处在自我抑制状态。当EED通过其芳香笼与H3K27me3结合后，PRC2变构，EZH2与EED、SUZ12相互作用，降低了EZH2自我抑制作用，转而增强其组蛋白甲基化转移酶活性，催化H3K27甲基化，形成正反馈环[14,17]。这种EED读取，EZH2写入的“写入与读取”机制构成PRC2结合H3K27me2/me3形成广泛染色体结构域的分子基础，在每个细胞分裂周期中产生基因抑制作用[14]，调节转录抑制[18]。

PRC2催化H3K27甲基化并非稳定的流水线作业。PRC2对于不同甲基化水平的H3K27催化速度不同。PRC2催化H3K27me1和H3K27me2非常高效[19]，而H3K27me2转变为H3K27me3则需要花费更多的时间[19]。不同甲基化程度的H3K27显示不同的基因分布及功能。H3K27me1占1个细胞中组蛋白H3总量的5%～10%，富集于激活转录基因。H3K27me2比例较大，占组蛋白H3总量的50%～70%，覆盖于基因间和基因内，阻止不恰当的启动子和增强子激活[10]。H3K27me3占组蛋白H3总量的5%～10%，能够压缩染色质，抑制转录[20]、富集的位点和PRC2结合位点重合，主要位于启动子，其他基因位点则处于低表达量[10]。

4 H3K27M突变的影响

整体H3K27me2/me3水平下降特异性的见于H3K27M突变，少见于H3K27I突变[2]，H3.3G34R/V突变胶质瘤中并未出现H3K27me3减少，故而推测H3K27M突变抑制PRC2催化活性[2, 21]。导致H3K27me3减少或重新分布[8, 22-23]，以及H3K27ac表达增加[2]。

关于H3K27M如何影响PRC2活性，H3K27me3整体表达水平下降的机制尚不清楚。目前有几种推测：(1)H3K27M竞争结合PRC2，导致其隔离失活。晶体结构研究显示，H3K27M肽比野生型H3肽对PRC2的亲和性高16～20倍[21,24]，使H3K27M突变组蛋白与PRC2强力结合，导致PRC2在异常基因位点沉积、隔离和失活，致使H3K27me3整体水平下降[6]。(2)H3K27M与PRC2结合后导致其效能降低，动态分析研究显示H3K27M肽和PRC2之间相互作用是动态的，不是静止不变的。起始阶段，PRC2被临时招募到包含H3K27M染色体上，导致PRC2在异常基因位点沉积，不能作用于正常位点[23]。进入稳定状态后，H3K27M与PRC2呈互斥状态，大量PRC2从H3K27M染色体中释放出来，进行再分布。虽然被H3K27M释放出来，但PRC2活性受到持续性抑制或者降低[17,23]。其对染色质的搜索时间延长，增加了特定靶点的采样间隔时间，叠加部分PRC2滞留于异常位点，导致PRC2有效浓度下降，进一步降低H3K27三甲基化率[21]。(3)H3K27影响EZH2自甲基化。PRC2经历各种共价翻译后修饰，如磷酸化、类泛素化及甲基化。其中PRC2自甲基化主要靶点为EZH2。EZH2自甲基化能够增强其组蛋白甲基化转移酶的活性[18]。EZH2自甲基化能够促进PRC2变构活性及其与组蛋白H3K27结合。在H3K27M突变的细胞中，EZH2自甲基化消失[14]。体外实验研究显示，EZH2甲基化环突变主要影响H3K27me2转变为H3K27me3，从而H3K27三甲基化水平降低[14]。

5 H3K27M突变后H3K27me3表达变化

在H3K27M突变的肿瘤细胞中，H3K27me3整体表达水平下降，但不同基因位点上，H3K27me3表达程度不同。研究显示，H3野生型细胞中包含强、弱两种多梳靶点。弱多梳靶点以孤立或短CPG岛(CPG islands, CGIs)和低PRC2/H3K27me3密度为特征。强多梳靶点以簇状或长CGIs及高PRC2/H3K27me3密度为特征[8]。由于在肿瘤细胞中，组蛋白H3K27M突变仅出现于一侧等位基因，突变蛋白仅占总组蛋白H3的一小部分(3.63%～17.61%)[2]。因此在弱多梳靶点，少量的H3K27M掺入已经完全抑制有限的PRC2活性，导致H3K27me3减少、丧失。强多梳靶点可能有更多PRC2结合位点，H3K27M的掺入量不足以减少总体PRC2活性。因此，强多梳靶点H3K27me3水平不会受到明显影响[8]。除了强弱多梳靶点外，有一些位点H3K27me3表达增加，且与初始的H3K27me3水平无关[8]。研究显示，野生型H3细胞中不存在该位点，且与H3K27M突变细胞中H3K27me3表达降低或不变的位点相比，这些位点由不同的机制调节，具体机制尚不清楚[8]。

目前，H3K27M突变如何影响PRC2活性，使不同位点H3K27me3富集量呈现出不同的变化，有待于更加深入的分析。

6 H3K27M突变对肿瘤发生的影响

研究表明，H3K27M突变能够调节神经元前体细胞(neuronal precursor cell, NPC)增殖及分化的基因表达增加，促进细胞的生长，增强前体细胞自我更新和增殖[25]。研究人员建立多种模型分析H3K27M突变诱发肿瘤的机制。推测伴有H3K27M突变的核小体一方面阻碍PRC2对维持细胞未分化状态的关键基因发挥抑制作用，另一方面将PRC2限制在激活细胞分化的基因上，持续抑制该基因的分化激活功能，增加细胞的增殖潜能并降低其分化能力[26]。蛋白质组学分析进一步解释PRC2的缺失导致组蛋白翻译后修饰的整体变化原因：(1)转录抑制修饰H3K27me3的大幅减少；(2)抑制性标记H3K27me2广泛分布；(3)其他抑制标记如H3K9me3或H4K20me3的补偿性增加；(4)活性染色质标记的显著增加，包括H3K27ac和H3K36me3[27]。推测PRC2在弥漫中线胶质瘤生长过程中持续发挥作用，整体的PRC2功能是维持肿瘤状态所必需的[26]。

正常情况下，H3K27me3负责抑制性翻译后修饰(posttranslational modification, PTM)，调节涉及发育、细胞命运及分化方向的基因[25,28]。H3K27me3主要在抑制性位点，H3K4me3与活性启动子相关，被H3K27me3和H3K4me3联合标记的启动子称为“二价”启动子，处于静止状态[29]。当H3K27M突变致使H3K27me3表达降低，进而释放静止的启动子，使其激活并上调，导致在细胞发育转变过程中表达的基因上调[25]。不仅H3K27me3下降对肿瘤发生、发展有影响，H3K27me3在H3K27M突变细胞中保留或富集，也影响肿瘤的发生。在突变细胞中H3K27me3富集于CDKN2A位点及CGIs的相关基因上[8]。p16INK4A(位于CDKN2A位点受INK4A编码)是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞周期中起抑制性作用，保护细胞免受肿瘤介导的转变。肿瘤激活会诱导其强表达[30]。在H3K27M突变肿瘤中，高水平的H3K27me3位于INK4a启动子，导致p16INK4A表达降低，降低其在细胞周期中的抑制作用，可能与肿瘤的发生、发展有关[8]。

7 靶向治疗方法

针对H3K27M突变引起的一系列改变，靶向药物试图从以下几个方面改善、治疗弥漫中线胶质瘤。在H3K27M突变的肿瘤细胞中，组蛋白修饰酶活性不平衡，导致组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases， HDAC)过表达；HDAC抑制剂Panobinosta被纳入药物实验[31]。这类药物导致组蛋白尾聚乙酰化，并意外发现H3K27三甲基化表达增加，其缓解了H3K27M对PRC2抑制作用[32]。因此，甲基化/乙酰化平衡的整体调节被视为转变H3K27M突变引起的级联反应的新治疗方法[33]。另一种恢复H3K27me3的方法是抑制H3K27去甲基化酶KMD6。去甲基化酶抑制剂GSK-J4可以抑制KMD6基因家族成员JMJD3。在体外实验和原位脑肿瘤模型中，GSK-J4是细胞增殖的有效抑制剂，促进K27M肿瘤细胞凋亡[34]。由于慢性Panobinosta暴露导致肿瘤细胞药物耐受，而GSK-J4和Panobinostat具有协同增强作用[32,34]。此外，GSK-J4通过恢复H3K27甲基化，间接修饰DNA结构，降低染色质开放程度，防止DNA启动子和远端结合位点接近，从而降低涉及DNA损伤修复相关基因的表达[35]。与放疗协同作用时，将增强放疗对DNA的损伤作用，促进细胞凋亡或死亡[35]。

目前，有关EZH2抑制剂对肿瘤细胞效用的体内外研究结果不统一。体内实验中，EZH2抑制剂可以显著抑制肿瘤生长，延长生存期；但在体外实验中仅能短暂抑制肿瘤细胞增殖[36]。因此，未来还需更多的研究来探讨其作为抑制剂的效用。

综上所述，H3K27M作为一个启动突变，通过抑制PRC2变构活性、催化效能或自甲基化水平，导致H3K27me3表达降低或者再分布。虽然多数时候H3K27me3表现为抑制作用，但仍有部分位点表达升高，这些变化在肿瘤的发生中起重要作用。H3K27me3在不同位点富集量的改变，只是肿瘤发生的其中一点；H3K27me3与其他因子相互作用，以及在细胞发育不同阶段的作用，还需进行更深入的分析。