基于共聚焦显微镜图像拼接方法分析干眼患者角膜神经形态

李方烃 沈重成 英鑫 徐慧雯 李天宇 李光旭 陈智超 张钦 赵明威

作者单位：北京大学人民医院眼科 眼病与视光医学研究所 视网膜脉络膜疾病诊治研究北京市重点实验室 北京大学医学部眼视光学院 100044

角膜作为全身中神经分布最为密集的组织[1]，角膜神经除了其重要的感觉作用，其还承担着反应性控制基础泪液的分泌、瞬目以及角膜上皮的迁移和增殖[2-4]等作用。干眼为多因素引起的慢性眼表疾病，是由泪液的质、量及动力学异常导致的泪膜不稳定或眼表微环境失衡，可伴有眼表炎性反应、组织损伤及神经异常，造成眼部多种不适症状和（或）视功能障碍[5]。近年来研究发现角膜神经的异常及改变是干眼主要的病理生理机制之一[2]。

随着角膜活体共聚焦显微（In vivo confocal microscopy，IVCM）技术的广泛应用，国内外学者使用IVCM观察角膜、结膜上皮密度，结膜鳞状上皮化生以及角膜神经等的改变[6-9]。角膜上皮下神经纤维在干眼中的病理变化以及重要作用已经得到广泛的认知[2]。但既往对干眼患者的角膜上皮下神经的形态研究结果却大相径庭。有研究发现干眼患者的角膜上皮下神经纤维密度较健康人群明显减少[10-12]；另有研究发现干眼患者较正常人群角膜上皮下神经密度并无明显改变[13-14]。出现研究结果差异巨大的原因之一可能是目前IVCM分析神经的方法存在着明显的局限性，临床上广泛应用的IVCM为海德堡HRT-Ⅲ共聚焦显微镜，其得到的是分辨率为1 μm，面积为400 μm×400 μm的角膜图像。此前研究采取的方式是选取不同部位多个角膜图像进行分析并取平均值[15-16]，但由于不同部位角膜上皮下神经密度存在差异，此方法可能出现选择偏倚因而会造成误差，这也可能是导致不同研究中结果差异的原因之一。为此，我们设计通过拼接角膜上皮下神经图像方式得到连续、大面积的角膜上皮下神经图像，减小选择偏倚导致的误差。本研究通过使用角膜IVCM采集干眼患者角膜上皮下神经纤维图像，拼接合成得到连续的大面积的角膜上皮下神经拼接图像，比较拼接图像分析方法与传统分析方法在角膜神经形态方面及其与干眼临床指标之间的相关性是否存在差异。

1 对象与方法

1.1 对象

纳入标准：①年龄18～65 岁；②根据干眼专家共识[5]，具有干眼症状，泪膜破裂时间（Tear break up time，TBUT）≤5 s或NIKBUT＜10 s；或患者有干眼症状，但TBUT＞5 s且≤10 s或NIBUT为10～12 s，则角膜荧光素钠染色阳性（≥5个点）。排除标准：①自身免疫性疾病，包括干燥综合征、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等；②移植物抗宿主病；③活动性结膜炎或角膜炎；④3 个月内使用除人工泪液外的滴眼液（如糖皮质激素滴眼液、免疫抑制剂滴眼液）或曾配戴角膜接触镜者；⑤6 个月内使用过临时泪道栓子和永久泪道栓子或进行过眼科手术；⑥合并糖尿病，严重的慢性心、肝、肾、肺功能不全，严重耐药菌感染，恶性肿瘤，精神病患者等影响用药及不能配合者。

连续收集2021年1—5月北京大学人民医院门诊诊断为干眼的患者16 例（16 眼），所有受检者均进行病史询问、裂隙灯显微镜检查、无创伤泪河高度（Noninvasive tear meniscus height，NITMH）、无创伤泪膜破裂时间（Noninvasive tear break up time，NITBUT）、TBUT、角膜荧光素染色（Corneal fluorescein staining，FL）评分、睑板腺缺失比例、基础泪液分泌试验（Schirmer Ⅰ test，SⅠT）和IVCM检查。本研究遵循赫尔辛基宣言，经北京大学伦理委员会批准（批号：2020PHB291-01），受检者均签署知情同意书。

1.2 检查方法

所有患者进行双眼完善的眼表检查，包括眼表分析仪检查（NITMH、NITBUT、睑板腺红外成像）、TBUT、FL、SⅠT及IVCM等。

1.2.1 眼表分析仪检查 由同一检查人员使用Oculus Keratograph 5M（Oculus Keratograph，德国Oculus公司）检测NITMH、NITBUT、睑板腺红外成像，分别对上下睑睑板腺进行评分，评分标准为：0分：无明显睑板腺缺失；1分：缺失小于全部睑板腺1/3 面积；2 分：缺失全部睑板腺面积1/3～2/3；3分：缺失大于全部睑板腺2/3面积。将上下睑睑板腺评分相加获得最终评分（0～6分）[17]。

1.2.2 TBUT检查 在裂隙灯显微镜钴蓝弥散光源下，以患者睁眼时立即用秒表开始计时，嘱患者持续保持睁眼，观察角膜表面荧光素钠涂布情况，直到角膜出现1个黑斑时停止计时。

1.2.3 FL评分 TBUT计时结束后，观察患者角膜各方位荧光素染色情况，以美国国立眼科研究所（National Eye Institute，NEI）评分方法进行评估并记录[18]。

1.2.4 SⅠT检测 将泪液试纸条上缘（天津晶明新技术开发有限公司）放在下睑中外1/3 处的结膜囊内，其余部分就自睑裂悬挂在眼睑之外，嘱患者闭眼休息5 min，5 min记录试纸条湿润长度。

1.2.5 共聚焦显微镜检查方法 使用IVCM（HRT-3型，德国Hidelberg公司）中“RCM”模块观察角膜上皮下神经结构。检查方法：检查前对受检眼进行表面麻醉（0.4%奥布卡因滴眼液，日本参天制药）2次，同时将有润滑作用的卡波姆凝胶（德国博士伦公司）涂于IVCM镜头，并在其上安装1次性角膜接触帽（德国Heidelberg公司），受检者前额及下颌分别固定于前额架及下颌托上，采用“Sequence”模式进行连续拍摄。手动调整采集位置，连续采集角膜上皮下神经图片。

1.3 角膜上皮下神经分析

1.3.1 传统分析方法 由同一研究者选取5张单张无重复的角膜上皮下神经图片，使用Neuron J（瑞士生物医学图像工作组）描绘角膜上皮下神经图片中的角膜神经纤维，并提取图像面积、神经总长度（图像中神经总长度）、神经密度（图像中每平方毫米神经总长度）、平均神经长度（图像中平均神经长度）、最长神经长度（图像中最长的神经长度）、最短神经长度（图像中最短神经长度）、神经数量（图像中总的神经纤维数量）、神经数量密度（图像中每平方毫米神经纤维数量）数据进行分析，5张无重复的角膜上皮下神经纤维图片数据取平均值。

1.3.2 角膜拼接图片分析方法 同一研究者使用Image J（美国国立卫生研究院）将2张连续采集的相邻图像中重合区域进行标记，应用Stitching插件中的Pairwise stitching将2张图片融合拼接为1张图片，以此将同一患者角膜上皮下神经图片全部进行拼接得到1张大面积角膜上皮下神经图片（见图1）。若采集的相邻图像出现畸变则去除此畸变图像，寻找神经清晰无畸变的相邻图片进行拼接；若相邻采集图片之间差异较大，拼接后神经连续性出现明显问题，则放弃2张图片的拼接。由同一研究者使用Neuron J分别描绘角膜拼接后图像的角膜神经纤维，并提取图像面积、神经总长度、神经密度、平均神经长度、最长神经长度、最短神经长度、神经数量、神经数量密度等数据进行分析。

图1.传统角膜神经分析方法与角膜神经拼图分析方法的比较A：共聚焦显微镜采集角膜上皮下神经图像（400 μm×400 μm）；B：传统方式使用Neuro J描绘角膜上皮下神经；C：同一患者拼接后角膜上皮下神经图像；D：使用Neuro J描绘拼接后角膜上皮下神经图像Figure 1.Comparison of the traditional corneal nerve analysis method and the new mosaic image processing method.A:IVCM corneal subbasal nerve image (400 μm×400 μm).B:Traditional corneal nerve analysis method using Neuro J.C:The same patient's corneal nerve image using the mosaic image processing method.D:Using Neuro J to analyze the corneal subbasal nerves in the processed image.IVCM,in vivo confocal microscopy.

1.4 统计学方法

系列病例研究。采用SAS软件（版本9.4）进行数据的统计分析。本研究纳入患者右眼数据进行统计分析。2种角膜神经分析方法中的角膜神经分析数据呈非正态分布，采用Wilcoxon秩和检验比较2种方法数据的差异。干眼临床指标以及角膜神经分析数据呈非正态分布，采用Spearman相关分析干眼临床指标之间的相关性及其与角膜神经数据的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及干眼临床指标

本研究共纳入干眼患者16 例（右眼16 只），均为女性，年龄19～61（中位数35.5）岁。干眼临床指标：NITMH中位数0.16 mm，NITBUT中位数3.91 s，TBUT中位数3.5 s，FL评分中位数0.5，SⅠT中位数10 mm，睑板腺红外照相评分中位数3。其中NITMH与TBUT呈正相关（r=0.65，P=0.007），FL与年龄呈负相关（r=-0.64，P=0.007），SⅠT与NITBUT、TBUT、FL均呈负相关性（r=-0.62，P=0.010；r=-0.55，P=0.026；r=-0.60，P=0.015）。

2.2 IVCM分析结果

传统方法和拼接图像方法分析角膜上皮下神经形态所获得的各角膜神经指标见表1。拼接图像方法得到分析面积中位数为2.93 mm2，而传统方法面积为0.16 mm2，2种方法得到的面积差异有统计学意义（P＜0.001）。拼接图像方法在神经总长度、平均神经长度、最长神经长度、神经数量方面均明显大于传统分析方法（均P＜0.001），最短神经长度较传统分析方法短（P＜0.001），神经密度较传统方法高（P=0.049），差异均有统计学意义。但拼接图像方法得到的神经数量密度与传统方法得到的神经数量密度差异无统计学意义（P=0.111）。见表1。

2.3 2种方法获得的角膜神经指标与干眼指标的相关性

在传统分析方法中，NITBUT与平均神经长度、神经数量、神经数量密度均有相关性（r=0.52，P=0.037；r=-0.62，P=0.011；r=-0.62，P=0.011）。在拼接图像分析方法中，NITBUT与平均神经密度呈负相关（r=-0.56，P=0.025），其余角膜神经指标与干眼指标均无相关性。

3 讨论

在角膜神经研究中，通过测量IVCM下角膜上皮下神经长度、神经密度、神经数量等参数来量化评估角膜神经[19]。由于不同位置角膜上皮下神经分布不均匀[20]，研究发现单张角膜上皮下神经纤维图像分析结果的可重复性及可靠性较差，因此目前大多数对角膜神经研究所采用的方式是使用多张不同位置的角膜上皮下神经图像分析后取平均值，从而得到相对更好的可重复性结果，如Vagenas等[16]研究发现随着统计图像数量的提高，数据准确性也有所提高。而目前传统的分析角膜上皮下神经图像方法仍是选择5～8 张不同位置的神经图片进行分析，这可能导致了既往不同研究对干眼患者角膜神经分析的结论出现较大的差异[10-14]。

表1.传统角膜神经分析方法与角膜神经拼图分析方法比较Table 1.Comparison of traditional corneal nerve analysis method and the new mosaic image processing method

目前仅选用不同部位的5～8 张角膜神经图片进行分析是因为一方面，选取的图片越多，图像分析的工作量会更大；另一方面，图像数量的增多会造成统计重复部位的可能性增加，造成选择的偏倚，降低神经统计结果的可靠性。目前已发表的各项研究中基本均采用由同一研究者进行角膜神经图片的选择和分析以减小误差，但不同研究中研究者选取的角膜神经位置不同以及研究者分析的差异都会增加误差，可能导致不同研究间的结果出现差异[21-22]。既往研究中曾尝试采用1 mm2的角膜神经拼图进行神经分析，但其相对面积较小，并且未与传统方式比较，未能体现拼接图像分析方法的优势，亦未能推广角膜神经拼接分析方法[23]。

本研究通过对角膜上皮下神经纤维图像进行拼接从而得到较传统方式更大范围面积的角膜神经纤维图片，经分析发现，拼接方式得到分析面积中位数为2.93 mm2，而传统方法面积仅为0.16 mm2，由于拼图方式得到的图片是连续的角膜上皮下神经，使得选择角膜神经图片位置所造成的选择偏倚消失，同时完全避免了出现重复位置分析的可能性，能够更加准确、全面地反映患者角膜上皮下神经的形态。通过对比拼接图像分析与传统分析方法发现，在角膜神经长度、角膜神经密度、平均角膜神经长度、最长角膜神经长度这几个重要的角膜神经指标方面这2 种分析方法的差异均有统计学意义。尤其是角膜神经密度，其是评估多种全身及角膜神经疾病（如糖尿病神经病变、干眼、干燥综合征等）的重要指标[10，24-27]，分析方式的误差可能会对研究结论造成巨大影响，采用拼接图像处理方法避免了重复计量等问题，大幅增加数据可靠性。在传统抽样分析的方法中，研究者需要从已扫描的图片中选择数张作为最后的分析图片，但是角膜上皮下神经分布的不均匀导致研究者无法判断所选图片是否具有代表性，是否一定没有重叠，可能会带来选择偏倚，因此以往研究需要评估角膜神经分析数据的可重复性[21-22]，但拼图方式去除了选择偏倚因素，使得可重复性大幅度提高。

本研究发现拼接图像方法可以在更大范围内获得角膜神经长度、神经密度等数据，对神经长度和神经密度采样范围极大提升，从而增加数据可靠性。在角膜神经指标与干眼临床指标的相关性分析上，也发现2种不同的角膜神经分析方法导致了NITBUT与角膜神经指标相关性的差异，使用拼接图像分析发现NITBUT与神经纤维密度存在相关性。说明新的角膜拼接分析方法会对干眼临床评估指标的研究结果产生影响，我们认为拼接神经分析数据能更全面、更准确地反映患者角膜神经形态特点，从而使角膜神经形态与干眼指标相关性分析的结论更为准确、可靠。

但本研究目前仍存在一些不足。首先，大面积的拼图需要获得大量同一平面的角膜上皮下纤维图像，而其获取需要较高技术的检查人员以及患者相对良好检查配合度，这在一定程度上限制了其应用的范围。其次，大面积的图片拼接是一个工作量巨大而极其繁琐的工作[28]，手动拼接无法实现大样本量研究。我们认为计算机辅助拼接是目前的解决方案[29]，并在积极尝试，而人工智能则是图像拼接技术的未来发展方向。此外，IVCM图像质量也是重要限制因素。由于光学渐晕效应导致IVCM图像边界区域比中心区域亮度低，图像在拼接处产生伪影[30]，造成角膜结构不清晰。目前研究团队正在尝试通过自适应渐晕矫正方法来提高拼接图像质量，让角膜拼接后神经结构更加清晰。同时，角膜神经拼接得到了以往分析方法所无法达到的更大面积、更大范围的角膜神经图像，以往的神经分析指标主要是针对0.16 mm2（400 μm×400 μm）的小面积图像进行分析，如角膜神经长度、角膜弯曲度等指标，没有针对更大面积角膜神经的形态分析方法，后续研究中我们将尝试针对整体神经形态的分析方法。本研究的主要局限性是样本量较小，由于角膜上皮下神经拼图对IVCM图像采集的质量要求相对较高，导致现阶段采集大量优质IVCM角膜上皮下神经图像用于拼接较为困难，我们将在后续研究中完善方法，从而采集更多数据作为下一步研究的支撑。其次，本研究缺乏健康及重度干眼对照组，研究中入选的均为轻中度干眼患者，若能添加重度干眼患者或健康人群作为对照，比较2种分析方法在不同人群中角膜神经分析结果与干眼各项指标的相关性结果的差异，将更能体现新分析方法的优势，我们将在进一步研究中加入对照组进行研究分析。最后，本研究未进行干眼症状评分与角膜知觉检测，此前有研究报道干眼症状评分和角膜知觉与角膜神经形态存在相关性[10]，而本研究未纳入此2种指标进行相关性分析。

综上所述，本研究使用IVCM角膜上皮下神经纤维图片拼接方法得到1张连续、大面积的角膜神经图像，对其神经形态进行分析，并与传统角膜神经方法进行比较，结果发现干眼患者使用拼接方法分析的神经面积明显高于传统方法。与传统神经分析方法比较，拼接图像分析方法在神经总长度、平均神经长度、最长神经长度、神经数量方面均明显高于传统分析方法，拼接图像分析方法中角膜神经密度也较传统方法高。但2种分析方法在角膜神经数量密度差异无统计学意义，同时2种分析方法获得的角膜神经指标与部分干眼临床指标的相关性结果存在差异。拼接方法可以更大范围、更准确、更可靠地评估干眼患者角膜上皮下神经。今后，我们将使用拼接图像分析方法对不同的类型和病情程度的干眼患者的角膜神经形态进一步研究，从而更准确评估角膜神经在干眼中的重要作用。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明李方烃：收集数据；选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。沈重成：收集数据；参与资料的分析和解释。英鑫：收集数据；数据整理。徐慧雯：数据统计。李天宇、李光旭、陈智超：图像整理、处理。张钦：参与选题、设计和修改论文的结果、结论；根据编辑部的修改意见进行核修。赵明威：修改论文中关键性结果、结论；根据编辑部的修改意见进行核修