富含γ-氨基丁酸的青花菜芽菜酸奶的研制

寇德麟，杨丰伟，吴征宇，刘晴晴，毛碧莹，谢柯沁，王鸿飞，许 凤

（宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315211）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种天然的非蛋白质的功能性氨基酸[1]，也是一种新型的功能食品因子[2]，许多研究表明，它在降低血压[3]、诱导放松和增强免疫[4]、改善视觉皮层功能[5]、提高肝脏应激功能、降低癌症发病率等多个方面[6-7]起到重要的作用，因此研发富含GABA的相关产品是当前研究的重点。植物性来源的GABA因其安全性高而受到广泛的关注，但大多数植物体内的GABA含量很低，仅为0.3～32.5μmol·g-1[8-9]，因此采用适当的方法使植物体内的GABA得到有效的富集可以拓宽目前GABA的植物性来源。前期研究发现，外源甘露糖处理青花菜芽菜可以通过GABA富集的两条途径影响GABA含量，且不影响芽菜本身的功能性物质[10]。

近年来，随着居民生活水平的提高，人们对食品营养健康方面注重程度提高，酸奶因其丰富的营养价值而受到消费者青睐[11-12]。通过在乳制品中加入适当的功能性物质可以提高其市场竞争力[13-14]。Abdel-Hamid等[15]研发了一种具有抗氧化性和抗菌活性的添加罗汉果提取物的酸奶，付荣霞等[16]也研发了一种具有良好食疗效果的山药薏米芡实褐色酸奶。传统生产过程中，在酸奶发酵以后加入水果果粒、果蔬汁等添加物，但它们不参与发酵[17]。相关研究发现，在发酵过程中，微生物的代谢作用可以影响果蔬本身的活性物质[18]，例如范媛媛等[19]利用乳酸菌和酵母菌协同发酵发芽糙米来制备GABA。韩梅等[20]虽然也研制了一款富含GABA的酸奶，但其是利用优化后的菌种进行发酵制成的，而通过外源添加富含GABA的青花菜芽菜，同时利用乳酸菌发酵来进一步提升其含量的方法研究较少。

本试验通过向酸奶中添加青花菜芽菜，并利用发酵技术来制作一种富含GABA的酸奶，通过单因素和响应面试验研究青花菜芽菜添加量、白砂糖添加量、菌种接种量和发酵时间对酸奶品质的影响，并测定最优条件下制备出的青花菜芽菜酸奶的各项理化指标，为功能性乳制品的研发开拓新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

青花菜种子：品种为炎秀，日本坂田；全脂纯牛奶：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；葡萄糖：南京甘汁园糖业有限公司；5菌型酸奶发酵剂：北京川秀科技有限公司；白砂糖：太古糖业有限公司；次氯酸钠、甲醇、氯化镧、氢氧化钾、硼砂、四硼酸钠、苯酚、无水乙醇，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

DYJ-S6108型种子机：广东佛山小熊官方旗舰店；AFX-2001-U型超纯水机：上海纯浦实业有限公司；745型紫外分光光度计：上海美谱达科技有限公司；BPZ11D型分析天平：德国赛多利斯公司；FJL型酸奶发酵机：烟台凯达电器有限公司；DW-HL528型超低温冷冻储存箱：中科美菱低温科技股份有限公司；RT2122型电磁炉：美的集团；XHF-D型高速分散器（内切式均质机）：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最适外源糖处理芽菜浓度的筛选

1.2.1.1 青花菜芽菜的培养

挑选完整、饱满、无病害的种子，用1.5%次氯酸钠消毒15 min，纯净水冲洗3次，30℃水浴4 h，将种子置于发芽机中。分别配制浓度为0、30、60、90、120、150 mmol·L-1的葡萄糖溶液作为培养液，每天更换培养液。培养8 d后去除芽菜根部取样，用液氮速冻后置于-80℃冰箱进行后续试验。

1.2.1.2 GABA的提取

准确称取0.4 g样品置于研钵中，加入400μL甲醇研磨，静置，待甲醇完全挥干后加入2mL 70mmol·L-1氯化镧，转移到5 mL离心管中，室温下振荡15 min，10000 r·min-1离心15 min。转移1.6 mL上清液到新离心管中，加入320μL 1 mol·L-1氢氧化钾，室温振荡5 min，上清液即为待测液体。

1.2.1.3 GABA含量的测定

GABA含量测定参考Hu等[21]的方法。取0.2 mL上清液按顺序加入0.6 mL 0.2 mol·L-1硼酸缓冲液（pH 9.0）、2 mL 5%苯酚溶液、1 mL 6%次氯酸钠溶液并分别摇匀，放入沸水浴中加热5 min，并立即冰浴5 min，溶液出现蓝绿色，此时加入2.0 mL 60%酒精终止反应，在645 nm处测定吸光度。分别配制浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g·mL-1的GABA标准溶液，按照上述方式测定相应的吸光度，并以吸光度为纵坐标，相应的GABA质量浓度为横坐标，绘制GABA含量的标准曲线并拟合标准方程。试验重复进行3次。

1.2.2 青花菜芽菜酸奶制作工艺流程

青花菜芽菜、全脂纯牛奶、白砂糖→调配→均质→灭菌→冷却→接种→密封发酵→后熟→成品

1.2.3 操作要点

1.2.3.1 青花菜芽菜的处理

按照“1.2.1”的方法，以最适葡萄糖处理浓度培养青花菜芽菜，将芽菜去除根部、挑除种皮后，用无菌纱布包裹，放入沸水中煮1～2 min，沥干残余水分。

1.2.3.2 调配、均质

奶瓶使用前沸水浴高温灭菌，倒置冷却干燥，加入均质后的青花菜芽菜、纯牛奶、白砂糖，适当加热使白砂糖溶解。

1.2.3.3 灭菌、冷却

将混合均匀的乳制品在高温下灭菌处理，迅速盖上盖子，保持密封状态，在室温下冷却。

1.2.3.4 接种、发酵

在无菌操作的条件下分别在冷却的乳制品中接入发酵剂，充分混匀并封口。设置发酵温度为42℃，发酵后呈凝固状态的酸奶即为半成品。

1.2.3.5 后熟、成品

将酸奶在4℃条件下冷藏后熟16 h即为成品。

1.2.4 富含GABA酸奶的感官评定细则

邀请15位有一定感官评定基础的食品学院学生组成感官评定小组，分别从色泽、滋味、组织、气味4方面对酸奶进行感官评定，评价标准见表1。

表1 富含GABA的青花菜芽菜酸奶感官评价标准Table 1 Reference of sensory score indicatorsof GABA riched broccolisprout yogurt

1.2.5 单因素试验设计

设置基础试验条件为：青花菜芽菜添加量2%，白砂糖添加量7%，菌种接种量0.3%，发酵时间6 h。改变单一因素用量，分别考察不同青花菜芽菜添加量（0、1%、2%、3%、4%）、白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）、菌种接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及发酵时间（4、5、6、7、8 h）对酸奶感官评分的影响，确定各因素的最适范围。

1.2.6 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，利用Box-Behnken试验设计原理，以感官评分为响应值，利用Design-Expert 11.0软件对试验数据进行处理，从而确定最优的富含GABA青花菜芽菜的酸奶发酵工艺，试验因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 酸奶中GABA含量测定

方法同“1.2.1.3”，将酸奶于10 000 r·min-1条件下离心5 min，取0.2 mL酸奶上清液进行试验。

1.2.8 理化及微生物指标测定

1.2.8.1 酸度及蛋白质含量

酸度：使用酸度计测定。

蛋白质含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[22]中的分光光度法测定。

1.2.8.2 微生物指标

乳酸菌：采用GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[23]中乳酸细菌培养基（MRS）培养基的方法测定。

金黄色葡萄球菌：采用GB 4789.10—2016《食品国家安全标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[24]中金黄色葡萄球菌平板计数法测定。

1.2.9 数据处理

采用Origin Pro 9.0和SPSS 21.0软件进行数据处理分析，用邓肯氏多重比较法进行差异显著性检验，P＜0.05为差异显著。以上指标均取3个平行样，重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 最适外源糖处理浓度对青花菜芽菜培养中GABA含量的影响

由图1可以看出，在不同浓度的葡萄糖处理下，青花菜芽菜中的GABA含量呈现下降—上升—下降的趋势，在处理浓度为120 mmol·L-1时达到最高。因此，选用浓度为120mmol·L-1的葡萄糖培养出来的芽菜GABA富集效果最好。

图1 不同浓度的葡萄糖处理对GABA含量的影响Fig.1 Effectsof different glucoseconcentrationson GABA contents in yogurt

2.2 单因素试验结果

2.2.1 青花菜芽菜添加量对酸奶感官评分的影响

由图2可以看出，在芽菜添加量为0～2%时，随着芽菜添加量的增加，酸奶的感官评分随之升高，正是由于芽菜的加入，使酸奶具有良好的色泽（呈青绿色）且具有芽菜的独特清香。在芽菜添加量达到2%时，酸奶的色泽与口感都达到最好的平衡；而当芽菜添加量大于2%时，感官评分明显下降，是因为过多加入芽菜会产生苦涩味，且芽菜气味过浓掩盖了酸奶本身的气味。因此，选择青花菜芽菜的添加量为1%～3%进行后续响应面试验。

图2 不同青花菜芽菜添加量对酸奶感官评分的影响Fig.2 Effects of different broccolisprout additionson sensory scores of yogurt

2.2.2 白砂糖添加量对酸奶感官评分的影响

由图3可以看出，白砂糖添加量在5%～7%时，感官评分逐渐上升，可能是因为含糖量的上升，甜味更加突出，掩盖了芽菜本身带有的苦涩味。而白砂糖添加量大于7%时，产品感官评分显著降低（P＜0.05），可能是由于含糖量过高，使人产生甜腻感。闫志鹏[25]研制的姜汁酸奶最佳配方中白砂糖的添加量同样也为7%，而袁云霞等[26]研制的西瓜椰果粒酸奶中虽然白砂糖的最适添加量为6%，但是果粒本身具有一定的甜味，所以适当降低白砂糖添加量可赋予产品更好的口感。因此，选择白砂糖添加量为6%～8%进行后续响应面试验。

图3 不同白砂糖添加量对酸奶感官评分的影响Fig.3 Effectsof different granulated sugar additionson sensory scores of yogurt

2.2.3 菌种接种量对酸奶感官评分的影响

由图4可以看出，菌种接种量在0.1%～0.3%时，感官得分呈现持续上升的趋势，当菌种接种量大于0.3%时，产品感官评分变化不明显，表明此时菌种已经达到饱和，对酸奶的评分影响不明显。董悦阳等[27]在麻山药酸奶中的接种量同样为0.3%，束俊霞等[28]在研究紫薯酸奶时对发酵剂的添加量有不同的结论，这可能是由于菌种种类不同导致。因此，本研究选择菌种添加量范围为0.2%～0.4%来进行后续响应面试验。

图4 不同菌种接种量对酸奶感官评分的影响Fig.4 Effectsof different lactobacillus additionson sensory scoresof yogurt

2.2.4 发酵时间对酸奶感官评分的影响

由图5可以看出，发酵时间在4～6 h时，随着时间的延长，酸奶中的菌群拥有更为充足的时间分解蛋白质，营造更为良好的感官品质。而当发酵时间大于6 h时，感官评分明显下降，可能是由于菌群大量繁殖，代谢产物大量积聚，使酸奶过酸、产生异味等现象。尹雄等[29]所研制的云南小粒咖啡果皮粉发酵酸奶和屈小媛等[30]研制的黑树莓酸奶在单因素试验中采用的最佳发酵时间均为6 h，这与本研究试验结果一致。因此，酸奶的发酵时间在5～7 h为宜。

图5 不同发酵时间对酸奶感官评分的影响Fig.5 Effects of different fermentation time on sensory scores of yogurt

2.3 响应面优化结果与分析

在单因素试验的基础上，依据Box-Behnken原理，分别以白砂糖添加量（A）、菌种接种量（B）、发酵时间（C）、青花菜芽菜添加量（D）这4个因素作为考察因素，研究各因素间交互作用对富含GABA的青花菜芽菜酸奶品质的影响，响应面试验结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and resultsof response surfaceexperiment

通过软件Design-Expert 11.0对青花菜芽菜酸奶试验数据进行多元响应面分析，经拟合得到多元回归模型，表4为回归模型的方差分析结果。将响应值与各个因素进行回归拟合，得到回归方程：

根据表4的回归模型方差分析可知，该模型P值＜0.000 1，说明回归模型极显著，证明该模型较理想，且失拟项P值（0.596 7）＞0.05，不显著，表明该回归方程拟合度较高，误差对试验结果影响较小。

表4 回归模型的方差分析Table4 Variance analysisof regression model

从回归方程系数显著性检验可知，一次项A、C和D对青花菜芽菜酸奶的感官评分影响极显著（P＜0.01），交互项AB、AD和二次项A2、B2、C2、D2对青花菜芽菜酸奶的感官评分影响均达到极显著（P＜0.01）水平，BC对青花菜芽菜酸奶的感官评分影响显著（P＜0.05）。由各因素F值的大小可知，对酸奶感官评分影响程度大小依次为：白砂糖添加量＞青花菜芽菜添加量＞发酵时间＞菌种接种量。通过对方程的手动优化，去除不显著的B、AC、BD和CD项后，得到优化后的方程为：Y=97.66+1.48A+1.38C+1.39D+2.63AB+4.19AD-2.02BC-7.91A2-2.28B2-3.83C2-8.84D2，优化后的方程能够很好地拟合真实值。

续表4 回归模型的方差分析Continue table4 Variance analysisof regression model

根据Design-Expert 11软件得到的响应曲面图和等高线图可以直观地表示响应值与因素水平之间的关系[31]。由图6可知，6个响应面图都是开口向下的，说明酸奶感官评分在试验设计的范围内存在最大值。通过软件可以预测出青花菜芽菜酸奶的理论最佳制作工艺条件为：白砂糖添加量7.1%，菌种接种量0.29%，发酵时间6.19 h，青花菜芽菜添加量2.1%，此时酸奶的感官评分最高，为97.95分。

图6 各因素交互作用对酸奶感官评分影响的响应面图和等高线图Fig.6 Responsesurfacediagramsand contour mapsshowinginteraction effectsof variousfactorson sensory scoresof yogurt

2.4 验证试验

为了方便进行试验操作，将响应面预测的最优工艺进行一定的修正，即：白砂糖添加量7.1%，菌种接种量0.3%，发酵时间6.2 h，青花菜芽菜添加量2.1%。在该工艺条件下，分别进行3次验证试验，测得酸奶感官评分平均值为98.5分，与响应面预测结果无显著性差异，说明本试验中得到的青花菜芽菜酸奶的制作工艺可靠。

2.5 酸奶产品中GABA含量检测结果

在上述最佳工艺条件下测得的酸奶GABA含量达0.789 g·L-1，而未添加青花菜芽菜的酸奶中GABA含量为0.245 g·L-1，说明通过添加青花菜芽菜发酵酸奶能使GABA含量有明显提高。

2.6 酸奶产品理化及微生物指标检测结果

经检测，酸奶产品酸度值为41°T，蛋白质含量为30.25 g·L-1，乳酸菌数量为1.5×108CFU·mL-1，未检出金黄色葡萄球菌，符合国家乳制品要求。

3 结论

在酸奶中加入葡萄糖处理后的青花菜芽菜共同发酵，制成富含GABA的酸奶，既符合当代人的健康需求，也起到了良好的保健功效，同时，酸奶中添加适量的青花菜芽菜，不仅可赋予酸奶清新的口感，还可让人在视觉上有更舒服的感受，具有很高的商业价值。经过单因素试验及响应面优化得到酸奶制作最佳工艺参数为：白砂糖添加量7.1%，青花菜芽菜添加量2.1%（采用120 mmol·L-1葡萄糖溶液培养青花菜芽菜），菌种接种量0.3%，发酵时间6.2 h。在此工艺条件下，酸奶中的GABA有明显的富集，达到0.789 g·L-1，且理化指标和微生物指标均符合国家标准。