外周血PNPLA3 rs738409基因多态性与非酒精性脂肪性肝病遗传易感性研究*

李 伟，黄 宇，钟 璟，韦 隽

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种常见的肝病，在世界范围内发病率大约为25%[1]。随着肥胖、2型糖尿病和高血压等发生率不断上升，NAFLD患病率亦呈上升趋势[2]。NAFLD发病机制尚不明确，通常认为是由遗传因素和环境因素等多种因素共同作用所致[3]。不断有研究指出，基因多态性与NAFLD遗传易感性有关[4]。patatin样磷脂酶结构域蛋白3(patatin like phospholipase domain containing protein 3，PNPLA3)是patatin样磷脂酶家族成员之一。国外文献[5,6]报道，PNPLA3 rs738409基因多态性与NAFLD患病有关。但国内有关PNPLA3 rs738409基因多态性与NAFLD遗传易感性的报道并不多见。本研究通过分析外周血PNPLA3 rs738409基因多态性探讨了其与NAFLD遗传易感性关系，旨在为发现我国NAFLD患者新的遗传危险因素，从而为尽早识别易感人群提供线索。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2017年11月～2019年11月我院诊治的NAFLD患者162例，男性52例，女性110例；年龄为33～71岁，平均年龄为(52.1±9.1)岁。NAFLD诊断符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南 (2018年版)》的标准[7]，影像学检查确定存在脂肪肝的表现。排除标准：(1)合并药物性肝损伤、自身免疫性肝病、病毒性肝炎；(2)严重的器质性疾病；(3)长期饮酒且酒精摄入量为男性>140 g/周，女性>70 g/周。选择同期体检的健康人群100例，男性36例，女性64例；年龄为32～72岁，平均年龄为(52.5±9.3)岁。纳入健康人群无糖尿病、心脏病、高血压、肝肾功能异常和不饮酒。两组研究对象均签署知情同意书，本研究方案符合《赫尔辛基宣言》及其准则，并通过我院医学伦理委员会审核。

1.2 临床资料的收集 收集入选对象性别、年龄、身高、体质量、腰围和臀围，计算体质指数(BMI)=体质量(kg)/身高2(m2)，腰臀比=腰围(cm)/臀围(cm)。常规检测血生化指标。

1.3 外周血PNPLA3 rs738409基因测序和分型 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法检测外周血PNPLA3 rs738409位点多态性，取外周静脉血3 mL，立即置入EDTA抗凝管中，采用全血基因组DNA提取试剂盒(购于深圳子科生物科技有限公司)提取基因组DNA。调整DNA浓度为50 ng/ μL，行PCR扩增(试剂盒购于上海百奥生物科技有限公司)，PCR扩增体系为：Taq Buffer 5.0 μL，10mM dNTP 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板1.0 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，ddH2O 10.5 μL，总体积为20 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃终止延伸10 min。对扩增产物进行电泳和纯化，将纯化产物送至上海生工有限公司测序(美国ABI公司的ABI PRISM3730测序仪)，从而确定该样本的基因型。PNPLA3 rs738409位点上游引物：5＇-CCTGAAGTCCGAGGGTGT-3＇，下游引物：5＇-CGGGTAGCCTGGAAATAG-3＇，扩增产物为387 bp，引物由上海生工有限公司合成。

2 结果

2.1 一般资料 NAFLD组体质指数、腰臀比以及血清TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、GGT和ALP水平显著高于对照组(P<0.05，资料未列出)。

2.2 PNPLA3基因型Hardy-Weinberg遗传平衡情况 PNPLA3 rs738409位点基因型包括GG、GC和CC型三种基因型。经Hardy-Weinberg检验，NAFLD组与对照组人群PNPLA3基因分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性(P>0.05，表1)。

表1 PNPLA3基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验(%)分析

2.3 两组PNPLA3基因rs738409位点多态性分布比较 NAFLD组PNPLA3基因rs738409位点GG基因型和G等位基因分布频率显著高于对照组(P<0.05，表2)。

2.4 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血生化指标比较 不同PNPLA3 rs738409基因型的NAFLD患者血清ALT和AST水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，GG和GC基因型NAFLD患者血清ALT和AST水平显著高于CC基因型NAFL患者(P<0.05，表3)。

2.5 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血脂和相关指标比较 GG和GC基因型NAFLD患者血清TG水平显著高于CC基因型NAFLD患者(P<0.05)，GG基因型血清TG水平显著高于GC基因型(P<0.05，表4)。

表2 两组PNPLA3基因rs738409位点基因型分布(%)比较

表3 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血生化指标比较

表4 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血脂和相关指标比较

3 讨论

NAFLD是一种常见的慢性肝病。在过去几十年间，我国NAFLD发病率呈现不断增长的趋势，且越来越低龄化，可能与我国人口饮食结构、生活方式转变和物质生活水平提高关系密切[8]。有证据[9]表明，NAFLD与肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征和遗传多态性密切相关，是由环境因素和遗传因素共同作用的结果。目前认为，NAFLD发病经典机制为肝脏“二次打击”学说，基于肝细胞内TG过度沉积的“初次打击”和由炎症因子、氧化应激同时参与的进一步加重肝细胞坏死所引起的肝纤维化过程。近年来，全基因组关联研究分析和候选基因研究从分子水平上加深了对NAFLD发病机制的理解[10]。

PNPLA3位于22q13.31，编码一个481个氨基酸组成的非分泌性蛋白，具有酰基水解酶活性，属于非Ca2+依赖的patatin样磷脂酶家族[11]。PNPLA3在N端具有类似于patatin的结构域，即高度保守序列Gly-X-Ser-X-Gly，对甘油(三酰甘油、二酰基甘油和单酰基甘油)具有水解酶活性，在脂代谢稳态过程中发挥着至关重要的作用[12]。PNPLA3基因在人体肝脏组织表达最丰富，但PNPLA3蛋白的生物学功能尚未完全阐明。国外已开展的研究表明PNPLA3基因rs738409多态性与NAFLD遗传易感性有关，但其影响NAFLD的具体作用机制有待深入探究。全基因组关联研究显示，PNPLA3基因rs738409位点C>G是拉美裔、非裔美国人和欧洲裔美国人NAFLD发生的危险因素[13]。对多个种族人群的进一步研究证实了PNPLA3 rs738409 I148M对NAFLD易感性的影响[14,15]。本研究结果显示，NAFLD患者PNPLA3基因rs738409位点GG基因型和G等位基因分布频率显著高于健康人群，编码GG基因型和G等位基因携带者NAFLD遗传易感性明显增加。体外实验证实PNPLA3蛋白具有水解甘油三脂的生物学功能，但其在体内的生物学活性尚不明确。动物实验研究[16]表明，PNPLA3对小鼠肝脏甘油三酯水解具有抑制作用。此外，与PNPLA 3(I148M)相关的脂肪变性是由PNPLA3在肝脏脂滴上的积累引起的，PNPLA3在肝脏脂滴上的积聚是肝脏脂肪变性的基础[17]。故PNPLA3蛋白可能更多参与脂肪合成过程而非脂肪分解过程，而PNPLA3基因rs738409位点C突变为G，导致148位异亮氨酸突变为蛋氨酸，PNPLA3基因rs738409位点多态性改变了PNPLA3蛋白活性中心结构，使得酶活性中心被掩盖，进而影响脂肪合成和水解过程，最终导致肝脏脂质沉积。研究[18]也表明，PNPLA3基因rs738409位点非同义替换突变(C>G)与肝脏脂肪沉积增加具有相关性，GG基因型人群肝脏脂肪含量显著升高。文献研究[19]亦发现，PNPLA3特定位点点突变可显著影响PNPLA3蛋白功能活性，其中最重要的突变即为PNPLA3 rs738409位点突变，且G等位基因发生肝硬化的几率是C等位基因的3.9倍，G等位基因与脂肪变性、小叶炎症、NAFLD活性评分和纤维化也有显著相关性。本研究结果也发现，GG和GC基因型NAFLD患者血清ALT、AST、TG水平显著高于CC基因型NAFLD患者，GG基因型高于GC基因型，故携带GG和GC基因型NAFLD患者肝功能损伤可能更加严重，其TG水平更高，肝脏脂质积累更多。PNPLA3基因rs738409位点等位基因C突变为G，削弱其对脂肪代谢的调节作用，从而导致脂质异位沉积和胰岛素抵抗。血清ALT和AST水平上升可能与携带GG和GC基因型NAFLD患者肝细胞损伤以及肝脏炎症活动更加严重有关。但三种基因型NAFLD患者血清GGT、ALP、HDL-C、LDL-C、BMI、腰臀比比较，差异无统计学意义，提示PNPLA3 rs738409基因多态性与NAFLD疾病严重程度的关系可能较复杂，有待进一步研究。一项分析PNPLA3 rs738409多态性与NAFLD易感性的研究[20]发现，PNPLA3 rs738409位点CG/GG基因型增加了巴西受试者NAFLD患病风险，且PNPLA3 rs738409位点GG基因型与非酒精性脂肪性肝炎患者肝酶升高和纤维化有关。总之，G等位基因可能是NAFLD遗传易感性的重要影响因素，即PNPLA3 rs738409基因多态性与NAFLD遗传易感性存在关联性。研究报道[21]表明，PNPLA3 I148M变异体与NAFLD发病风险显著相关，CG基因型增加发病机会2.092倍，GG基因型增加4.566倍。故PNPLA3 rs738409基因多态性可能在NAFLD发病过程中发挥着关键作用，但PNPLA3 rs738409基因突变可能并不仅仅是单纯的功能丧失，其能否单独引起脂肪肝还有待深入研究。通过深入研究PNPLA3基因在NAFLD发病过程中的作用机制，为深入阐明NAFLD遗传易感性及其发病的分子机制提供了新的方向，从而有助于筛选NAFLD高危人群，做到尽早预防、诊断和个体化治疗。

综上所述，PNPLA3 rs738409基因多态性与NAFLD遗传易感性有关。该项研究将有助于指导尽早识别NAFLD易感人群，从而为NAFLD防治提供方向。