三七总皂苷对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织脂质沉积及NO/iNOS/NF-κB通路的影响*

2022-03-21 12:25侯文靖吴广明盖慧慧
实用肝脏病杂志 2022年2期
关键词:辛伐他汀脂质沉积

侯文靖,吴广明,盖慧慧

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是临床常见的肝脏疾病,是指排除酒精及其他明确的导致肝损伤的因素引起的肝细胞内脂肪堆积过多,肝脏脂质过度沉积为典型特性的综合征,属于获得性代谢应激肝损伤性疾病[1]。据文献报道称,全世界约有10亿人患有NAFLD,其发病率高达25%,且随着世界范围内肥胖和糖尿病等人口数量的不断增加,NAFLD的发病率和死亡率也逐年上升[2,3]。依据NAFLD病理学改变程度的不同,可将其分为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)以及NASH相关肝硬化,其中约有20%NASH会进一步进展至肝硬化[4]。NAFLD多由营养过剩、肥胖、高血糖、高脂血症等因素引起,也可由营养不足、短期内体质量快速下降和中毒等原因造成[5]。从中医角度看,NAFLD是由过食肥甘厚味、感受热邪、气滞血瘀等病因造成的肝气失衡、气血凝滞、痰瘀互结。治疗NAFLD的关键在于改善痰瘀互结之证,化痰祛瘀,使肝气通畅[6]。越来越多的研究发现,白藜芦醇和姜黄素等植物及中草药治疗NAFLD效果显著[7]。三七总皂苷(panax notoginsenosides,PNS)是从中药三七中提取的活性物质和有效成分,具有抗血栓、抗氧化、降血压、扩张血管和活血化瘀的药理作用[8]。本实验观察了PNS对NAFLD小鼠肝组织脂质沉积的影响,并探讨了其调控作用的机制,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物 40只雄性C57BL/6小鼠,4~8周龄,体质量为20~25 g,平均为(22.1±2.3) g,购自北京实验动物研究中心。

1.2 NAFLD小鼠模型的制备及药物干预 采用随机数字表法将40只小鼠分为对照组、模型组、PNS处理组和辛伐他汀处理组,每组10只。所有小鼠经适应性喂养,对照组10只小鼠仍保持正常饮食喂养,给予其他30只小鼠高脂饲料(80%正常饲料、3%胆固醇、7%猪油、10%蛋黄粉)喂养,以构建NAFLD小鼠模型。待建模成功后,给予模型组小鼠生理盐水灌胃,另两组分别给予PNS(昆药集团股份有限公司,国药准字Z53021369,2.5 g/L)溶液10 mL.kg-1.d-1灌胃或辛伐他汀(广州南新制药有限公司,国药准字H20010748,4.2 g/L)溶液10 mL.kg-1.d-1灌胃,各组持续灌胃处理12 w,期间仍保持高脂饲料持续喂养。在实验结束时,称质量,采取颈椎脱臼法处死小鼠,取血清、称肝脏、副睾脂肪和肾周脂肪质量,按照公式计算内脏脂肪比:内 脏 脂 肪 比=副 睾 脂 肪 质量(g)+肾 周 脂 肪(g)/体质量(g)×100%。

1.3 实验室指标检测 使用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的BS-280型全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)等血生化指标。

1.4 肝组织一氧化氮(nitric oxide,NO)-诱导型一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase,iNOS)-核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路蛋白表达检测 采用Western blot法检测,简述步骤如下:取小鼠肝组织,研磨、离心后弃上清,用预冷的PBS洗涤3次,加入蛋白裂解液进行裂解,行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h,电转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。加5%脱脂奶粉室温封闭1 h,用Tris-HCl缓冲盐-吐温溶液(Tris- buffered saline Tween20,TBST)洗膜3次,每次清洗10 min,分别加入抗NO、抗iNOS、抗NF-κB、抗p-NF-κB和抗β-actin【艾博抗(上海)贸易有限公司,工作浓度均为1:1000】,在4℃下孵育过夜。用TBST再次洗膜,用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗兔二抗【艾博抗(上海)贸易有限公司,工作浓度为1:3000】于室温下再次孵育1 h。用TBST重复洗膜3次,每次10 min。最后,用Western blot专用试剂(赛默飞世尔科技公司)显色成像,应用Image J分析各蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 各组肝组织病理学表现 对照组小鼠肝组织形态正常,结构清晰,肝细胞呈放射状分布,组织排列紧密,无脂肪空泡或炎症反应;模型组小鼠肝组织显示肝细胞肿胀、体积增大,细胞质内有弥漫性、大小不等的脂肪空泡,甚至伴有空泡融合挤压细胞核,部分细胞呈气球样变;PNS处理组和辛伐他汀处理组小鼠肝组织显示肝细胞肿胀不明显,肝脏体积相对缩小,细胞质内出现的脂肪空泡数量有所减少,细胞形态规则,排列整齐、大小均匀。

2.2 各组体质量、肝质量及内脏脂肪比比较 在实验结束时,PNS处理组和辛伐他汀处理组小鼠体质量、肝质量和内脏脂肪比显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05,表1)。

2.3 各组血脂水平比较 PNS处理组和辛伐他汀处理组血清TC、TG和LDL-C水平显著低于模型组,而血清HDL-C水平显著高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05,表2)。

表1 各组体质量、肝质量及内脏脂肪比比较

表2 各组血脂水平比较

2.4 各组血清ALT和AST水平比较 PNS处理组和辛伐他汀处理组血清ALT和AST水平显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05,表3)。

2.5 各组肝组织NO/iNOS/NF-κB蛋白表达水平比较 PNS处理组和辛伐他汀处理组肝组织NO/iNOS/NF-κB通路蛋白表达显著弱于模型组,差异有统计学意义(P<0.05,表4、图1)。

表3 各组血清ALT和AST水平比较

表4 各组肝组织NO/iNOS/NF-κB蛋白表达比较

图1 各组肝组织NO/iNOS/NF-κB蛋白表达水平比较与模型组比,①P<0.05

3 讨论

NAFLD是现阶段世界范围内肝病的重要发病原因之一,并成为未来几十年导致终末期肝病的主要因素,在成人和儿童,其发病率均高居不下[9]。NAFLD主要分为单纯性脂肪病变、NASH、肝硬化和肝细胞癌等[10]。现阶段,针对NASH和NAFLD诊断多采用肝组织活检,用于明确和诊断疾病分期。虽然此方法准确性高,但也存在侵入性,检测成本高,存在潜在并发症和观察者间个体差异等缺陷[11]。针对NAFLD的治疗,西医主要通过去除病因进行针对性辅助用药,给予二甲双胍或他汀类药物治疗,而中医则是通过辨证论治,依据患者症状及体质辨证用药[12]。PNS是从中药三七的根茎中提取的活性物质,具有活血化瘀的功效,研究证实在多种气滞血瘀引起的慢性疾病中疗效显著[13]。本研究采用PNS干预NAFLD小鼠,发现可显著改善模型小鼠肝脏脂质沉积。

最新的研究发现,采用高脂饲料喂养构建的NAFLD小鼠具有人类疾病的特征,对研究NAFLD的防治有着重要的参考意义[14]。本实验以高脂饲料持续喂养动物12周,构建NAFLD模型小鼠,再给予PNS等干预,实验结果表明,经PNS干预小鼠体质量、肝质量和内脏脂肪比显著低于模型组,血清TC、TG和LDL-C水平显著低于模型组,而血清HDL-C水平显著高于模型组。同时,血清ALT和AST水平也均显著低于模型组。这些结果显示PNS可有效改善NAFLD小鼠肝脂肪变性,减少肝脏脂质沉积。PNS减轻肝脏脂质沉积的作用可能在于其抗血栓、抗纤维化、抗氧化和活血祛瘀的独特药理作用,高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型血液流动性减缓,血液逐渐粘稠、凝滞,血脂代谢紊乱[15]。PNS通过抑制氧化应激反应,加速肝组织血液循环,抑制肝组织脂肪堆积,发挥良好的降脂效果[16],从而降低了小鼠体质量、肝质量和内脏脂肪比,并显著降低了血清TC、TG、LDL-C、ALT和AST等指标水平,提高了血清HDL-C水平,有效改善肝脏脂质沉积,与有关研究结果[17]相近。

NAFLD属于慢性炎症性疾病的一种。NO是通过调控细胞间信息交换参与介导炎症性疾病的重要信息载体。iNOS作为NO合成的限速酶,共同参与诱导包括NAFLD和肝纤维化在内的疾病进展[18],而NF-κB 则是公认的促炎、促肿瘤基因,在多种炎症性疾病发病过程中高表达[19]。本研究结果发现,NAFLD小鼠肝组织NO/iNOS/NF-κB通路蛋白表达显著强于正常小鼠,证实该通路在NAFLD发病过程中发挥促炎和促疾病进展的作用[20]。在经过PNS干预后,小鼠肝组织NO/iNOS/NF-κB通路蛋白表达被显著下调,推测PNS可能通过抑制NO/iNOS/NF-κB通路的活化发挥缓解脂质沉积效应。PNS的主要组成成分为人参皂苷和三七皂苷,两者皆有良好的抗炎活性[21]。PNS通过调节NAFLD小鼠免疫反应,防止因免疫过度引起的肝细胞和组织损伤,进而抑制炎症因子和信号通路的表达,最终发挥显著的抗炎效应[22],抑制模型小鼠肝脏脂质沉积,保护肝功能。

综上所述,PNS可能通过抑制NO/iNOS/NF-κB通路蛋白活化,显著减轻了NAFLD小鼠体质量、肝质量和内脏脂肪比,降低血脂水平,改善了脂质沉积。

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