肺炎链球菌的不同形态观察及临床药敏分析

麦婉湘，文宏宇，黄亚薇

广西壮族自治区桂林市中医医院检验科，广西桂林 541002

肺炎链球菌可作为定植菌定植于鼻咽部,也可引起感染,人类是其唯一宿主,通过人的飞沫和呼吸道分泌物传播,可引起败血症、脑膜炎、肺炎、中耳炎等。据世界卫生组织报道，肺炎链球菌每年大约造成160万人死亡，以发展中国家占多数，2018年的研究数据显示，全球因为感染肺炎链球菌而死亡的<5岁的儿童有29.4万名[1]，且中国儿童肺炎链球菌感染呈增加趋势[2]。抗菌药物仍是治疗肺炎链球菌感染的主要手段，青霉素为肺炎链球菌经验治疗的首选药物，但随着广谱抗菌药物的广泛使用，肺炎链球菌的耐药率不断上升，加强对抗菌药物耐药率的监测，及时发现耐药率的改变,熟悉本地区该菌的药敏特点对临床诊疗和合理应用抗菌药物有重大意义。本文从临床病例分离出的肺炎链球菌的菌落形态特点、临床分布、耐药率等方面进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 对2019-2020年本院住院及门诊病例的临床标本(包括痰液、血液、肺泡灌洗液、脓液、分泌物等)进行常规分离培养，剔除同一患者同一部位重复分离株，共93株肺炎链球菌纳入分析。

1.2仪器与试剂 血琼脂平板(郑州安图生物工程有限公司)，奥普托欣(Optochin)药敏纸片(温州市康泰生物科技有限公司)，10%去氧胆酸钠溶液(杭州天和微生物试剂有限公司)，DL-96STREP试剂板(珠海迪尔生物工程有限公司)，肺炎链球菌质控菌株ATCC49619(国家临床检验中心)。

1.3方法 各类标本严格按临床检验操作规程进行常规分离培养，其中，痰液标本需直接涂片进行质量评估，白细胞>25个/每低倍视野、鳞状上皮细胞<10个/每低倍视野为合格痰液，直接涂片镜下呈革兰阳性球菌，矛头状相对，与白细胞伴行、聚集或者被白细胞吞噬的标本需作为有效信息记录下来，接种培养后，选择可疑菌落(痰液标本需结合涂片信息情况)做Optochin试验、胆汁溶菌试验和珠海迪尔生物工程有限公司DL-96STREP试剂板的鉴定和药敏试验，Optochin试验敏感、胆汁溶菌试验阳性且DL-96STREP试剂板鉴定为肺炎链球菌的菌株共计93株，药敏结果判定使用美国临床和实验室标准协会CLSI2019标准。

1.4统计学处理 采用WHOET5.6软件对数据进行统计分析，计数资料以例数或百分率表示。

2 结 果

2.1性别年龄分布 男性多于女性，男性58例(62.4%)，女性35例(37.6%)；以老年人和儿童为主，老年人和儿童总体占89.2%，60岁以上老人20例(21.5%)，14岁以下儿童63例(67.7%)，其中4岁以下的婴幼儿53例，占同期儿童病例的84.1%。

2.2标本类型分布 93株肺炎链球菌中，痰液占93.5%，血液占3.2%，肺泡灌洗液、耳分泌物、脓液各占1.1%，见表1。

2.3形态观察 93株肺炎链球菌中，非黏液型菌落89株，占95.7%，黏液型菌落4株，占4.3%，均分离自儿童痰液标本。分离出该菌的痰液标本原始涂片镜下可见肺炎链球菌呈现矛头状，有荚膜，引起感染状态下与白细胞呈现吞噬或伴行的相关性。在血平板上，有两种不同的菌落形态，常见形态为非黏液型，呈中央凹陷似“脐窝”状，草绿色溶血，边缘整齐；黏液型不常见，仍有草绿色溶血，呈水状，圆形或边缘融合。两种形态菌落Optochin试验均为敏感，见图1。

表1 93株肺炎链球菌的标本类型分布

注：A为非黏液型菌落，呈中央凹陷状；B为非黏液型菌落Optochin试验敏感；C为黏液型菌落；D为黏液型菌落Optochin试验敏感。

2.4菌株科室分布 93株肺炎链球菌中，以儿科(65.6%)和心肺病科(9.7%)为主，急诊科占5.4%，康复医学科、脑病科、脾胃病科各占3.2%，肾病科、重症医学科、门诊各占2.2%，内分泌科、创伤科、外科各占1.1%，见表2。

表2 93株肺炎链球菌的临床科室分布

2.5药敏试验结果 93株肺炎链球菌中，对红霉素的耐药率为95.7%，四环素的耐药率为93.3%，克林霉素的耐药率为90.3%，头孢呋辛的耐药率为77.4%，复方磺胺甲噁唑的耐药率为60.2%，头孢曲松的耐药率为9.7%，利福平的耐药率为6.7%，美罗培南的耐药率为4.3%，阿莫西林/克拉维酸的耐药率为3.2%，左氧氟沙星的耐药率为2.2%，青霉素的耐药率为1.1%，利奈唑胺、万古霉素无耐药数据，见表3。4株黏液型肺炎链球菌对头孢曲松、利福平、美罗培南、阿莫西林/克拉维酸、左氧氟沙星、青霉素、利奈唑胺、万古霉素均敏感，对红霉素、克林霉素、四环素均耐药，头孢呋辛耐药1株、中介2株、敏感1株，复方磺胺甲噁唑中介1株、敏感3株,见表4。

表3 93株肺炎链球菌(非脑脊液)的药敏试验结果分析(%)

表4 4株黏液型菌株药敏试验结果(%)

3 讨 论

肺炎链球菌为咽喉部的定植菌，在机体低免疫状态下可致病，常引起呼吸道感染，也可引起侵袭性感染，是全球<5岁儿童和>65岁老年人的常见感染菌,也是导致上述人群死亡的重要原因,是一个严重的公共卫生问题[2]。本研究中老年人和儿童病例总体占比为89.2%，可见儿童可能存在的未健全免疫系统、不良营养状况，老年人基础疾病状态及组织器官功能的退化等是该菌致病的主要条件。痰液是该菌检出的主要标本类型，但在临床标本检验流程中，应对痰液标本进行质量评估，严格检验流程，结合临床，对该菌的定植或致病状态做出正确判断。

肺炎链球菌引起的感染从临床表现上无法确定感染源，诊治水平与实验检测水平在不同地区、医院差异较大[3]，在培养鉴定过程中，检验人员必须对该菌的菌落特点和鉴定流程有充分的认识和鉴别能力，才能准确快速分离出该菌。本研究分离的两种菌落形态中，非黏液型常见，呈中央凹陷似“脐窝”状，边缘整齐，黏液型菌落较少见，仍有草绿色溶血，但表面呈水状，圆形或连接成片，容易被误认为是铜绿假单胞菌等其他黏液型菌落，需加强对黏液型肺炎链球菌的认识和警觉，还需结合直接涂片中镜下是否有符合革兰阳性、成双、矛头状等特点的菌体，以及是否与白细胞呈相关性等进行综合分析，才能避免误检、漏检。黏液型菌落有厚荚膜并产生大量透明酸荚膜多糖，其致病性很强，93株肺炎链球菌中，黏液型4株均分离自儿童痰液标本，与国内报道均分离自成人不同，在同期儿童标本61例中占6.6%，高于文献报道[4-5]，黏液型肺炎链球菌在儿童病患中的分离率值得关注。

本研究药敏试验结果显示，肺炎链球菌对红霉素的耐药率最高，达95.7%，肺炎链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药机制主要为靶位的改变，即核糖体50s亚单位改变，由ersB基因介导[6]。欧美国家的数据表明，肺炎链球菌对红霉素的耐药率达50%以上[7]，在我国该类耐药情况更为严重，应避免经验用药。对克林霉素、四环素也同样呈高耐药状态，耐药率>90%，复方磺胺甲噁唑耐药率>60%，与耐药监测网统计数据相近[8]。而本研究中肺炎链球菌对头孢呋辛的耐药率高于全国耐药监测网和国内其他报道[9-12]，可能与菌株的地区流行及本地区用药习惯有关。对利福平、头孢曲松的耐药率<10%，阿莫西林/克拉维酸、左氧氟沙星、美罗培南的耐药率均<5%，与国内研究一致[13]，有较高的敏感率，可根据药敏试验结果及临床患者情况选择及调整抗菌药物的使用。肺炎链球菌对青霉素耐药率较低，为1.1%，可作为肺炎链球菌感染治疗的首选药物，但国内有较高耐药率的报道[14]，耐青霉素肺炎链球菌的机制是6种青霉素结合蛋白(pbp)发生改变，使得与青霉素的结合力下降，耐药率升高的情况与抗菌药物的过度使用有关[15]，应持续关注耐青霉素肺炎链球菌的耐药率并加强耐药监测。利奈唑胺、万古霉素敏感率较高，耐药菌株尚未检出，在临床上可用于治疗重症感染患者。

黏液型肺炎链球菌的耐药分析报道较少，因为荚膜较厚，有较强的致病性，不容易产生耐药性[4-5]。本研究中的4株分离自儿童病例的黏液型肺炎链球菌药敏结果显示：对头孢曲松、利福平、美罗培南、阿莫西林/克拉维酸、左氧氟沙星、青霉素、利奈唑胺、万古霉素均敏感，但对红霉素、克林霉素、四环素均耐药，与本地区肺炎链球菌对该3类抗菌药物高度耐药相近，复方磺胺甲噁唑敏感3株、中介1株，头孢呋辛耐药1株、中介2株、敏感1株，其耐药的情况高于国内其他文献报道[4、5]，尽管样本量小，但黏液型肺炎链球菌的耐药率值得关注和探讨。

综上所述，检验人员必须对肺炎链球菌的形态，特别是对非常规的形态和特征提高认识，规范鉴定流程，才能提高检出率，及时准确找出感染源，避免误检漏检。本研究的药敏试验结果显示，肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素有较高的耐药率，应避免经验用药，对青霉素、阿莫西林/克拉维酸、左氧氟沙星、美罗培南有较高的敏感率，建议根据具体药敏结果调整使用，利奈唑胺、万古霉素耐药菌株未发现，可用于重症感染的治疗。肺炎链球菌耐药率在不同地区有差异，跟本地区的流行情况、医院类型、用药习惯等有关，临床应对本地区肺炎链球菌的药敏情况有更多的了解和分析，积极检测病原菌，及时做药敏试验，加强耐药监测，才能为肺炎链球菌引起的各类感染性疾病提供更精准的抗感染治疗，遏制耐药趋势和高耐药水平菌株的出现。本研究中4株黏液型肺炎链球菌均分离自儿童病例，对部分抗菌药物的耐药情况比国内其他报道的耐药率高，其在儿童病患中的分离率及耐药率值得关注和探讨。近年来的研究显示，肺炎链球菌可以在毒力因子作用下存活于细胞内，抗感染更为艰巨和严峻[16]，疫苗接种是预防肺炎链球菌感染的有效手段。