蛇床子对HER-2阳性乳腺癌的作用及K-ras的影响

关灵 郑锐年 劳乔聪

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌的发病率逐年稳步上升，预计还会继续不断增加，是女性最常见的癌症相关死亡原因。乳腺癌的发病因素众多，大龄妊娠和生殖模式的改变以及母乳喂养持续时间的缩短促进了乳腺癌发病的加速进展[1]。虽然乳腺癌的诊断和治疗策略有所改进，但肿瘤转移、药物副作用和耐药性的诸多障碍仍然是对治疗的重大挑战。

癌细胞的转移侵袭是影响乳腺癌患者预后的重要因素，尤其是缺氧的肿瘤微环境导致大约一半的晚期乳腺癌患者对治疗表现出抵抗。根据基因表达谱，乳腺癌细胞可分为4个亚型：Luminal A、Luminal B、HER2过度表达、三阴型，其中乳腺癌中HER-2/neu阳性类型是难治肿瘤之一[2]。乳腺癌病灶部位的血管生成对肿瘤进展起到重要作用，HER-2对肿瘤的营养重要供应部位新生血管生成具有重要作用[3-4]。HER-2/neu是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的家族成员，其高表达对乳腺癌血管生成有促进作用，增殖迅速，恶性程度高，预后较差，K-ras基因与肿瘤的生成、增殖、迁移、扩散以及血管生成均有关系[5]。

植物化学药物对正常细胞的细胞毒性较低，但可能针对异质癌细胞和多种信号通路发挥作用。研究表明，植物化学药物对乳腺癌具有良好的治疗效果；包括 姜黄素、白藜芦醇和莱菔硫烷可诱导乳腺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞，并减少其增殖。此外，研究表明[6-7]，植物化学药物可以靶向化疗耐药的乳腺癌干细胞。因此，植物化学药物被认为是彻底治疗乳腺癌的有希望的药物[8]。香豆素及其衍生物的生物学效应已被广泛研究。香豆素衍生物已被用作抗凝剂、抗HIV药物和中枢神经系统疾病的治疗[9]。蛇床子素 [7-甲氧基-8-（3-甲基-2-丁烯基）香豆素] 是从蛇床子中提取的一种植物化学药物，广泛用作传统治疗。众所周知，蛇床子素具有抗炎、抗菌和抗过敏的作用[10]，并且由于其抗癌活性而受到越来越多的关注。蛇床子素也被认为对几种癌症有治疗作用，包括肺癌、肝癌、宫颈癌和卵巢癌。此外，蛇床子素诱导永生化肝癌细胞凋亡，抑制小鼠肝肿瘤的生长，但对HER-2/neu阳性乳腺癌的作用机制尚未完全阐明[11]。因此本研究拟分析K-ras基因和不同分期HER-2阳性乳腺癌的相关性及蛇床子对其调控作用，进而为临床上中医治疗HER-2阳性乳腺癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和分组

本研究所用HER-2/neu高表达4T1细胞由本实验室制备并冻存，蛇床子素由笔者所在医院药剂科提供并由制剂室煎制。细胞复苏后传代，所有细胞在DMEM培养基（Invitrogen）中培养，并添加10% FBS（Invitrogen）和1%抗生素（100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素），温度为37℃。将细胞分为两组，分别为4T1组作为对照组和Osthole组，在4T1细胞中加入20μM蛇床子素，作用48 h。

1.2 细胞增殖影响的分析

在定量增殖实验中，在常规培养基中种植细胞数，将消化之后的细胞按照设计的密度分别接种于24孔板中。清洗细胞，细胞附着于24孔板厚，然后抚育在含有5% CO2的培养基中。在各组细胞依照各个作用条件处理后分别再作用48 h。细胞增殖评价在第6 d使用自动细胞计数仪进行分析，吸光度使用分光计记录490 nm处的值进行分析。

1.3 Caspase3 活性检测

根据试剂盒说明进行，基于分光光度法生色团检测，从标记底物上解离后，DEVD-ρNA。首先用各组1×106细胞处理48 h，通过消化等方法收集细胞，反复清洗细胞后，在溶解缓冲液中溶解。细胞用半胱天冬氨酸特异性测定裂解产物的蛋白酶活性与显色分子ρNA结合的肽。这个caspase裂解生色团ρNA用波长405 nm的分光光度计分析。

1.4 Real-time PCR检测

用Trizol（Invitrogen）从各组细胞中提取总RNA。用检测试剂盒（QuantiTect reverse transcription kit，Qiagen，USA）从RNA逆转录中提取cDNA。使用SYBRTM绿色PCR试剂盒（Life Technologies）的实时PCR系统（Life Technologies，美国）。GAPDH被定义为内部参考。从每个实验组中提取用TRIzol试剂（Invitrogen）制备总RNA，然后用PureLink RNA mini kit（Invitrogen）进行提取并应用Nanodrop ND-100分光光度计测定RNA浓度（Nanodrop公司）。利用cDNA与2X iTaq通用SYBR绿色混合物（Bio-Rad）、200 nm通用PCR引物和200 nm PerfeCTa检测引物。cDNA合成应用iScript cDNA合成试剂盒（购自于Bio-Rad公司）。500 nm 双向引物和稀释后的（1∶10）cDNA分别混合（见表1）。应用Bio-Rad-CFX-96实时PCR（Bio-Rad公司）进行PCR反应。制备标准曲线后，利用2-△△CT计算表达量。

表1 引物序列

1.5 Western blot检测

使用加有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（ProMab Biotechnologies，Inc.，Richmond，CA，USA）提取总蛋白。蛋白质用10% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜（Invitrogen）上，然后与5%脱脂乳孵育1 h。接下来，将PVDF膜与小鼠抗人抗体，在4℃孵育过夜，然后用TBST洗涤3次，并用次级山羊抗鼠IgG HRP（1∶2 000，ab6789，Abcam）抗体孵育1 h。用TBST冲洗2次后，使用ECL Western印迹检测试剂（Amersham Pharmacia Biotech，Inc.）检测蛋白质，并使用BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce Biotechnology，Radford，IL，USA）定量。

1.6 观察指标

观察指标包括分析K-ras基因在不同分期HER-2阳性乳腺癌的表达；蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞增殖的影响；蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞凋亡活性的影响；蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞EMT的影响；蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞中K-ras基因表达的影响；蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞Ras/MAPK信号通路的影响。

1.7 统计学处理

利用R软件（3.6.3版本）（统计分析与可视化），分析TCGA 数据库中BRCA（乳腺浸润癌）项目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据和临床数据，转换成了TPM（transcripts per million reads）格式并进行log2转化后进行分析，用Mann-Whitney U检验（Wilcoxon rank sum test）分析。使用GraphPad Prism 6.0（GraphPad Prism 6.0软件，La Jolla，CA，USA）进行统计分析。数值记录为（±s）。

2 结果

2.1 K-ras基因在不同分期HER-2阳性乳腺癌的表达分析

利用TCGA 数据库中BRCA（乳腺浸润癌）数据库分析K-ras基因在不同分期HER-2阳性乳腺癌的表达分析，结果可见，K-ras基因表达在HER-2阳性乳腺癌显著增高。在不同TNM分期HER-2阳性乳腺癌中，可见K-ras基因表达显著增高，与TNM分期显著相关（见图1）。

图1 K-ras基因和不同分期HER-2阳性乳腺癌的相关性分析

2.2 蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞增殖的影响

MTT法分析蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞增殖的影响，结果可见，蛇床子可显著抑制乳腺癌细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图2）。

图2 蛇床子对4T-1细胞增殖的影响

2.3 蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞凋亡活性的影响

分析蛇床子对4T-1细胞凋亡因子Caspase 3活性的影响，进而分析蛇床子对4T-1细胞凋亡活性的影响，结果可见，蛇床子可显著促进乳腺癌细胞的Caspase 3活性增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图3）。

图3 蛇床子对4T-1细胞凋亡活性的影响

2.4 蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞EMT的影响

分析蛇床子对4T-1细胞中E-cadherin 和Vimentin 表达影响，进而分析蛇床子对4T-1细胞中EMT的影响，结果可见，蛇床子可显著促进乳腺癌细胞的E-cadherin表达增加，Vimentin 表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图4）。

图4 蛇床子对4T-1细胞EMT的影响

2.5 蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞中K-ras基因表达的影响

分析蛇床子对4T-1细胞中K-ras基因表达的影响，结果可见，蛇床子可显著抑制乳腺癌细胞的K-ras基因表达，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图5）。

图5 蛇床子对4T-1细胞中K-ras基因表达的影响

2.6 蛇床子对HER-2/neu 高表达4T-1细胞Ras/MAPK信号通路的影响

Western blot分析蛇床子对4T-1细胞Ras/MAPK信号通路的影响，结果可见，蛇床子可抑制4T-1细胞Ras/MAPK信号通路的激活，进而发挥调控作用（见图6）。

图6 蛇床子对4T-1细胞Ras/MAPK信号通路的影响

3 讨论

HER-2 阳性乳腺癌生长速度快，易复发，易转移，与细胞增殖、分化及细胞凋亡密切相关[12]。而对其治疗往往是具有相应的抵抗性，因此急需找到一个药物有效治疗HER-2阳性乳腺癌患者[13]。

蛇床子素（Osthole）来源于蛇床子植物中，是传统中药蛇床子的重要成分，研究[14]表明它的作用具有多样性，在治疗多种病理病变中具有不容忽视的药理作用，不仅可以用作治疗变态反应，抗风湿性疾病，治疗骨质疏松，在对抗恶性疾病中具有积极作用，已被广泛应用于临床治疗中。但蛇床子对HER-2阳性乳腺癌的作用和机制尚未见报道。本研究选用HER-2/neu 高表达的人乳腺癌4T-1细胞，进而分析蛇床子对HER-2阳性乳腺癌的作用。结果可见，蛇床子导致肿瘤细胞增殖活性受抑制，凋亡活性增加。众所周知，EMT发生和肿瘤的恶性进展密切相关，由于它能够改变细胞的生物性质，导致恶性增生细胞得以侵袭能力增强，进而转移等，因此是肿瘤进展的关键之一，其中是E-cadherin主要保证细胞之间的连接，防止恶性细胞从连接处突围而出，其表达的减少和Vimentin表达增加可促进上皮细胞-间充质转化（EMT）发生[9，15-16]。本研究证实，蛇床子素对HER-2/neu高表达的人乳腺癌4T-1细胞中EMT是发挥抑制作用。进一步分析其机制，K-ras基因是RAS基因家族成员之一， K-ras基因及其编码的蛋白和疾病的恶性进展具有显著关联，它的下游信号通路包括Ras/MAPK信号通路[17]。信号通路改变引起的异常细胞增殖和侵袭是癌症的标志。Ras/MAPK信号通路在正常细胞生理学中很重要，是治疗多种人类癌症（包括乳腺癌）的共同靶点。特别是，Ras/MAPK信号通路在肿瘤细胞增殖、生长和存活中起着重要作用。因此，Ras/MAPK信号通路在几种类型的癌细胞中被激活；HER2受体家族激活Ras/MAPK信号通路信号通路，并导致乳腺癌细胞中持续的增殖信号传导，通过磷酸化活化，进而相应活化相关细胞因子，从而促进恶性细胞的生存、分化、抑制凋亡等[18-19]。研究[15]发现，蛇床子素可抑制Ras/MAPK信号通路，并诱导HER2过度表达的乳腺癌细胞凋亡。此外，蛇床子素通过抑制大鼠胶质瘤细胞中的Ras/MAPK和ERK1/2信号通路抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡[13]。而本研究证实，蛇床子对HER-2/neu高表达的人乳腺癌4T-1细胞中K-ras基因可发挥抑制作用，进而抑制其下游信号通路Ras/MAPK信号通路，进而抑制细胞通路活化，抑制核转录因子激活，调控肿瘤细胞的增殖。

综上所述，K-ras基因表达增高和HER-2阳性乳腺癌不同TNM分期显著相关，蛇床子可调控K-ras基因，进而下调Ras/MAPK信号通路，抑制乳腺癌进展。本研究为蛇床子应用于HER-2阳性乳腺癌的治疗提供了理论依据。