乳酸链球菌素在延长猪肉干保藏期中的应用

张益卓，赵长青，赵兴秀，邹伟

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000)

随着人们生活质量的不断提高，人们对猪肉品质的要求越来越高，尤其是营养丰富、色泽诱人和耐储存的猪肉制品更受消费者关注。猪肉干是一种比较新颖的即食型肉制品，相比较牛肉干与猪肉脯等在市场中比较成熟的肉制品产品较少和鲜有研究。猪肉干主要以猪瘦肉为原料，经过切片、煮制、烘烤、包装和灭菌等步骤加工而成，猪肉干营养丰富、食用方便、口感独特，受到广大民众的喜爱[1]。猪肉干易滋生细菌，导致腐败变质，故在猪肉干加工过程中会添加大量的添加剂来稳定猪肉干的品质。目前市售的猪肉干所用的添加剂主要为谷氨酸钠、5′-呈味核苷酸二钠、脱氢乙酸钠、食用香精、D-异抗坏血酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯、红曲红等。由于人们对健康生态食品的不断追求，这些化学合成的添加剂正在逐渐被减量或零添加。探究天然无毒、防腐效果好、能够稳定猪肉干品质的天然防腐剂成为研究热点[2]。

乳酸链球菌素(Nisin)是一种由乳酸链球菌产生的具有抑菌性的多肽类物质，近年来，Nisin的应用在全球范围内受到了广泛研究[3-5]。Nisin作为一种天然防腐剂，已被广泛应用在稳定肉制品的品质与延长肉制品的保藏期中。Wang等[6]将Nisin、山梨酸钾和噬菌体制作成一种复合抑菌剂用于生鲜猪肉的保鲜，通过实验发现这种复合抑菌剂可显著降低猪肉的菌落总数、挥发性盐基氮(TVB-N)和硫代巴比妥酸值，复合抑菌剂的添加使猪肉的保藏期延长了14 d。Liu等[7]将Nisin、八角茴香精油和聚赖氨酸作为原料制备出一种纳米乳应用在肴肉中，检测结果发现纳米乳有效抑制了肴肉中细菌的生长，肴肉的pH值和TVB-N显著降低，纳米乳的添加使肴肉的保藏期从8 d延长到16 d。刘振东等[8]使用Nisin腌制藏猪肉，随后通过测定羰基和巯基含量发现添加Nisin的藏猪肉蛋白质氧化程度低于空白组，证明Nisin具有抗氧化的作用。另外，赵敏等[9]使用Nisin和乳酸对冷却猪肉进行防腐保鲜；王建清等[10]使用Nisin和罗勒精油对冷鲜猪肉进行保鲜，并进行了货架寿命研究。不过，尚未见有研究人员仅使用Nisin这一种防腐剂用于延长猪肉干的保藏期。

为评价Nisin作为天然防腐剂用来延长猪肉干保藏期的效果，本实验在猪肉干制作中仅添加Nisin这一种防腐剂，以3 d为一个周期对制作出的猪肉干产品的微生物数量(大肠菌群数、菌落总数、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌)和TVB-N含量进行为期120 d的测定，以检测Nisin对猪肉干中微生物的抑制能力；同时对猪肉干的pH、水分活度(Aw)和色泽进行测定，以检测Nisin对猪肉干品质的稳定作用。本实验将为使用Nisin延长猪肉干、其他品种肉干等肉制品的保藏期提供参考。

1 实验过程

1.1 材料与试剂

猪瘦肉、食盐、小茴香、白砂糖、香辛料、老抽酱油、生姜、菜籽油、麦芽糖：购于超市；Nisin(食品级，纯度99%)：河南万邦实业有限公司；乳酸钠(食品级，纯度60%)：河南博源生物科技有限公司。

氯化钠、氧化镁、硼酸：成都科隆化学品有限公司；微生物学检验中的所有培养基、肉汤、琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器

SS-8型切肉机 浙江省永康市我趣工贸有限公司；HN7Y-K9840型凯氏定氮仪 济南市海能仪器股份有限公司；HD-4型Aw测定仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；UItraScan VIS型色泽测定仪 上海信联创作电子有限公司；PH-100A型便携式pH计 浙江力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 五香味、麻辣味猪肉干的制作

1.3.1 猪肉预处理

选取形状大小接近的猪瘦肉块，先用流水冲洗，再用清水浸泡，然后用切片机将肉块切成长、宽、厚为6.0 cm×4.0 cm×0.4 cm的肉片。

1.3.2 初煮

取1500 mL自来水倒入锅中，放入2 g小茴香，水煮沸后放入1000 g猪肉片，当猪肉呈白色时结束初煮，捞出猪肉片。

1.3.3 复煮

1.3.3.1 五香味

弃去初煮汤汁中的沉淀，重新将猪肉片放入汤汁，放入复合调料包1包[11]，以及适量白砂糖、食盐、生姜、菜籽油等，在210 ℃条件下煮制5 min，调至130 ℃煮5 min，加入适量老抽酱油，在100 ℃条件下煮制40 min。

1.3.3.2 麻辣味

弃去初煮汤汁中的沉淀物，重新将猪肉片放入汤汁，放入复合调料包1包，以及适量白砂糖、食盐、生姜、菜籽油、干辣椒等，在210 ℃条件下煮制5 min，调至130 ℃煮5 min，加入适量老抽酱油，在100 ℃条件下煮制20 min，加入适量青花椒粉，再煮制20 min。

1.3.4 添加Nisin与烘烤

将复煮后的猪肉片捞出，将剩余复煮汤汁过滤后加入0.5 g Nisin，搅拌均匀后放入猪肉片，在80 ℃条件下煮制10 min。煮制结束后，将猪肉片平铺在吸油纸上，在85 ℃烘箱中烘烤90 min，制得猪肉干，作为实验组。同时，以不添加Nisin的猪肉干作为空白组。

1.3.5 包装与灭菌

在无菌条件下将猪肉干分装进7 cm×10 cm的透明包装袋(18丝)中并封口(每袋约4～6 g)，通过22.5 W紫外灯对包装好的猪肉干的每一面杀菌20 min。最后，将猪肉干保存在室温27 ℃下以进行微生物学检验(菌落总数、大肠菌群数、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌)、TVB-N、pH、Aw、色泽的检测。

1.4 猪肉干保藏期的测定

1.4.1 微生物学检验

1.4.1.1 菌落总数的测定

菌落总数的测定方法参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

1.4.1.2 大肠菌群数的测定

大肠菌群的测定方法参照GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》。

1.4.1.3 金黄色葡萄球菌的检测

金黄色葡萄球菌的检测方法参照GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》。

1.4.1.4 沙门氏菌的检测

沙门氏菌的检测方法参照GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》。

1.4.1.5 志贺氏菌的检测

志贺氏菌的检测方法参照GB 4789.5-2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》。

1.4.2 猪肉干TVB-N的测定

TVB-N的测定方法参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》。

1.4.3 猪肉干pH的测定

取5 g猪肉干样品搅碎，放入盛有45 mL蒸馏水的锥形瓶中，搅拌均匀，静置30 min后过滤，用便携式pH计测定滤液的pH。

1.4.4 猪肉干Aw的测定

取2.00 g绞碎的猪肉样品，均匀平铺于器皿中，使用Aw测定仪进行测定，测试时间为10 min。

1.4.5 猪肉干色泽的测定

使用白板校正后的色差仪对每个样品的3处随机部位进行测定，得到样品的L*(亮度)值、a*(红色度)值和b*(黄色度)值，并通过下式计算色差影响因素e。

1.5 实验数据统计分析

所有实验数据采用3次实验结果的平均值，并使用Origin 2017和Excel进行绘图和数据分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 猪肉干微生物学检验

按照GB 4789.1-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》中对肉干微生物的要求进行微生物学检验。在为期120 d的猪肉干保藏期间，以GB 2726-2016《食品安全国家标准 熟肉制品》对肉干中菌落总数≤10000 CFU/g，大肠菌群≤10 CFU/g，不得检出金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的规定为标准。若检测指标不符合国标规定，即视为该组猪肉干达到保藏期终点，进而停止后续实验。添加Nisin的猪肉干(实验组)和未添加Nisin的猪肉干(空白组)的菌落总数变化见表1。

表1 猪肉干保藏过程中菌落总数的变化

由表1可知，在为期120 d的保藏过程中，五香味和麻辣味猪肉干的空白组在第18天时菌落总数超标(≥10000 CFU/g)，即五香味和麻辣味猪肉干的空白组保藏期为15 d，所有空白组均未检出大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌。在第51天时，添加Nisin的五香味猪肉干菌落总数达到了(9800±1200) CFU/g，超出国标规定，进而判定五香味实验组过期，保藏期为48 d；而添加Nisin的麻辣味猪肉干在整个保藏过程中，菌落总数未超标，也未检出大肠菌群与致病菌，符合国标规定，保藏期至少为120 d。这是因为猪肉干的主要污染菌是乳酸杆菌、肉毒杆菌、葡萄球菌和李斯特菌等革兰氏阳性菌，而Nisin的抑菌能力强，对大多数革兰氏阳性菌可以发挥较好的抑制作用[12]。Nisin的抑菌作用机理主要是由于其带有大量带正电荷的、疏水性的肽类物质，这些肽类物质可吸附于革兰氏阳性菌的细胞膜上，形成通透孔道，导致细菌细胞内的K+等离子流失，导致细胞外的水分子流入，进而使得细胞死亡[13]。同时也由于Nisin在酸性条件和高温条件下稳定性好，所以适合用于猪肉干的保藏[14]。另外，由表1也发现五香味实验组的保藏期低于麻辣味实验组，这可能与麻辣味猪肉干中添加的辣椒和青花椒具有一定的抑菌效果有关[15]。

2.2 猪肉干TVB-N的测定

TVB-N是指在微生物的作用下使食品中的蛋白质分解而产生氨类或胺类等挥发性含氮物质，TVB-N含量越高，表示食品的腐败程度越高，因而可用TVB-N的含量判断食品的新鲜程度[16]。五香味和麻辣味猪肉干在保藏过程中的TVB-N含量变化见图1。

图1 各组猪肉干保藏过程中TVB-N含量的变化Fig.1 Changes in TVB-N content of each group of pork jerky during storage

由图1可知，五香味和麻辣味猪肉干空白组的TVB-N含量在保藏期终点第15天时分别为5.60 mg/100 g和8.40 mg/100 g，而五香味实验组的TVB-N含量在保藏期终点第48天时为6.53 mg/100 g，麻辣味实验组在第120天时为8.39 mg/100 g，空白组和实验组在各自的保藏期终点时均未超过国标规定(≥15 mg/100 g)。空白组猪肉干的TVB-N含量上升速率大，这可能是因为空白组猪肉干的菌落总数大幅度增加，大量繁殖的微生物导致肉干中的营养物质被消耗，从而使TVB-N含量在短时间内快速上升。实验组猪肉干的TVB-N含量虽然也随着保藏过程的进行而不断上升，但上升速率较小。由此可以看出，Nisin作为天然防腐剂应用在猪肉干中能够有效抑制肉干微生物的生长，发挥良好的防腐效果，延长猪肉干的保藏期。

2.3 猪肉干pH的测定

肉干pH不仅影响风味，还影响产品的保藏特性，是判定产品品质的重要指标。五香味和麻辣味猪肉干的pH见图2。

图2 各组猪肉干保藏过程中pH值的变化Fig.2 Changes in pH values of each group of pork jerky during storage

由图2可知，五香味和麻辣味猪肉干空白组的pH在保藏期终点第15天时分别为6.60和6.52，而五香味猪肉干实验组的pH在保藏期终点第48天时为6.36，麻辣味猪肉干实验组的pH在第120天时为6.23。随着保藏过程的进行，空白组和实验组猪肉干的pH均小幅度下降，这主要是由于发酵微生物的作用不断产生乳酸等降低pH的物质，使猪肉干的pH下降[17]。

2.4 猪肉干Aw的变化

Aw表示食品中水分与食品的结合程度，Aw直接关系到食品的保藏期。肉干制品的口感很重要，这使得肉干既要控制好水分含量，又不能使Aw太高，研究Aw对食品储存稳定性的影响具有十分必要的现实意义[18]。五香味和麻辣味猪肉干保藏过程中Aw的变化见图3。

图3 各组猪肉干保藏过程中Aw的变化Fig.3 Changes in Aw of each group of pork jerky during storage

由图3可知，五香味和麻辣味猪肉干空白组的Aw随保藏期的延长均有小幅度的下降和波动过程，五香味猪肉干空白组的Aw由初始的0.850降低至第15天的0.837，麻辣味猪肉干空白组的Aw由初始的0.840降低至第15天的0.835。而五香味猪肉干实验组的Aw由初始的0.850降低至第48天的0.817，麻辣味猪肉干实验组的Aw由初始的0.837降低至第120天的0.810。虽然低Aw可以抑制猪肉干中大部分微生物的生长，但仅当Aw<0.80时，大多数霉菌才不能生长，所以在测定菌落总数的琼脂培养基上还是会有菌落生长。而添加Nisin的猪肉干，由于Nisin的抑菌作用，使大多数微生物在较低Aw的条件下难以生长繁殖，延缓了猪肉干的腐败速度，使添加Nisin的猪肉干保藏期得到有效延长。

2.5 猪肉干色泽的变化

肉制品的色泽直接关系到消费者的购买意愿，色泽主要受原料、辅料、加工工艺以及保藏过程中产品品质稳定性的影响。本实验将色差影响因素e值作为猪肉干色泽的主要参数。五香味和麻辣味猪肉干在保藏过程中的e值见图4。

图4 各组猪肉干保藏过程中色泽e值的变化Fig.4 Changes in color e value of each group of pork jerky during storage

由图4可知，五香味猪肉干空白组的初始e值为0.74，麻辣味猪肉干空白组的初始e值为0.95；而对应的五香味猪肉干实验组的初始e值为0.54，麻辣味猪肉干实验组的初始e值为0.91。空白组的e值均高于对应的实验组，这可能是由于添加Nisin的猪肉干实验组煮制时间长于空白组。另外发现所有组的e值在整个保藏过程中呈现下降趋势，这说明保藏过程中微生物的生长繁殖会使猪肉干发生一系列化学反应，导致色泽变化[19]。由图4还可知，在整个保藏过程中，Nisin可以较好地稳定猪肉干的色泽和品质。

2.6 Nisin在肉干产品中的应用展望

本实验发现Nisin作为天然防腐剂应用在猪肉干中，保藏期明显高于未添加Nisin的猪肉干。在保藏过程中，由于Nisin的抑菌性强，对猪肉干易滋生的金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性污染菌产生了较好的抑制作用，另由于每1 kg生肉中仅需添加0.5元的Nisin，添加成本小，适合实际工业生产使用[20]。未来可以将Nisin联合其他天然防腐剂复配应用在牛肉干、鸭肉干和鸡肉干等常见肉干制品中。

3 结论

本实验选用Nisin作为天然的单一防腐剂在五香味和麻辣味猪肉干的保藏应用中，以猪肉干是否加入Nisin为依据，分为实验组和空白组，并以3 d为周期对各组猪肉干的微生物数量、TVB-N、pH、Aw、色泽进行为期120 d的检测，以验证Nisin的防腐效果。检测结果表明，未添加Nisin的五香味和麻辣味猪肉干空白组因菌落总数超标，不符合国标对肉干微生物数量的规定，故保藏期均为15 d。添加Nisin的五香味猪肉干实验组因菌落总数超标，同样不符合国标对肉干微生物数量的规定，故保藏期为48 d；麻辣味猪肉干实验组在第120天时各项指标均符合国标规定，故保藏期至少为120 d。这说明Nisin在五香味和麻辣味猪肉干中可以发挥较好的防腐作用，使五香味猪肉干的保藏期延长了33 d，麻辣味猪肉干的保藏期延长了至少105 d。五香味和麻辣味猪肉干空白组的TVB-N含量在保藏期终点分别达到5.60 mg/100 g(15 d)和8.40 mg/100 g(15 d)，而五香味和麻辣味猪肉干实验组的TVB-N含量为6.53 mg/100 g(48 d)和8.39 mg/100 g(120 d)，空白组TVB-N含量的上升速率大于实验组，说明Nisin在猪肉干中能够发挥较好的微生物抑制作用。另外，在整个保藏过程中，空白组和实验组的pH、Aw和色泽均有所下降，但空白组的下降速率大于实验组，说明Nisin能够稳定猪肉干的品质，从而延长保藏期。Nisin作为天然防腐剂，在肉干等肉制品的保藏中具有很高的研究价值。本实验证明了Nisin可在延长五香味和麻辣味猪肉干保藏期过程中发挥巨大作用，本实验也为Nisin在猪肉干、其他品种肉干及肉制品中的应用提供了参考。