2018-2020年克拉玛依市甲型H3N2流感病毒分子特征分析

刘 佳，李金鞠

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的上呼吸道传染性疾病，对健康的危害极大，是世界卫生组织列为实行全球监测的首要传染病。流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，由分8个节段的单股负链RNA组成，外部有包膜。根据核蛋白的抗原性分为甲、乙、丙、丁4个型别，根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)蛋白的抗原性差异，甲型流感病毒又可以分为多种亚型，目前人群中流行的主要是新甲型H1N1，H3N2，乙型Victoria与乙型Yamagata 4种亚型[1]。自1968年香港暴发H3N2流感大流行后，H3N2型流感病毒已成为流感流行的主要病原之一[2]。HA 和NA作为流感病毒主要表面抗原，是引起流感病毒发生抗原性漂移的主要因素，在病毒感染和传播过程中起着至关重要的作用。本研究通过分析2018-2020 年克拉玛依市H3N2流感病毒HA和NA基因的变异情况，及时掌握本地流感病毒流行动态和进化方向，为H3N2 的防治工作提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 采集2018年1月至2020年12月哨点医院流感样病例咽拭子2 073份，经Real-Time PCR鉴定127份为H3N2，20株用MDCK细胞完成病毒分离培养，其中18株测序成功(2018年初毒株2株，2019年底毒株9株，2020年初毒株7株)。

1.2 基因扩增和测序测定 采用Sanger测序方法测定HA和NA基因序列。上海伯杰生物有限公司负责完成此次扩增及测序工作。

1.3 基因序列比对及进化树构建 将WHO推荐的2017-2018年北半球H3N2流感疫苗株A/Hong Kong/4801/2014、2019-2020年北半球H3N2流感疫苗株A/Kansas/14/2017以及2013-2019年国内其他省份部分H3N2流感分离株作为参比序列，采用Mega多功能基因分析软件将已测定序列的分离株同参比序列进行比对和分析，比较其基因同源性、受体结合位点和糖基化位点。

2 结 果

2.1 HA和NA基因同源性与进化分析 HA和NA基因进化树分析结果显示(图1、图2)，HA基因经计算与A/Hong Kong/4801/2014同源性在98.63%～99.15%，与A/Kansas/14/2017同源性在97.60%～98.02%。2018-2020年克拉玛依市的流行毒株HA基因与2017-2018年北半球H3N2流感疫苗株A/Hong Kong/4801/2014较为接近，大部分与国内其他省份2017-2019年分离株在同一大分支上。NA基因经计算与A/Kansas/14/2017基因同源性在98.08%～98.70%，与A/Hong Kong/4801/2014同源性在97.01%～98.24%，与2019-2020年北半球H3N2流感疫苗株A/Kansas/14/2017较为接近，全部与同时期国内其他省份分离株在同一大分支上。

注：●为疫苗株 疫为克拉玛依市分离株；▲为克拉玛依市分离株；未标记为国内其他省份分离株。

注：●为疫苗株 疫为克拉玛依市分离株；▲为克拉玛依市分离株；未标记为国内其他省份分离株。

2.2 HA和NA基因抗原决定簇及受体结合位点分析 流感病毒H3亚型HA上有5个抗原决定簇(A、B、C、D、E)位于重链上。A位于由140～146位氨基酸形成的突出环上及133～137位氨基酸；B位于155～160位及球区末端围绕α螺旋结构的187～198位氨基酸；C位于球区下方52～54、275和277所在的区；D由207和174位等表面氨基酸组成，E由63、78、81位和83位形成的表面氨基酸区组成[3]。

相对于A/Hong Kong/4801/2014，克拉玛依市2018年初的毒株在HA抗原决定簇有6个氨基酸位点(135、142、160、193、198、53)发生了替换，共涉及3个抗原决定簇位点(A、B、C)；相对于A/Kansas/14/2017，2019年底至2020年初的毒株在HA抗原决定簇有7个氨基酸位点(135、137、144、159、160、53、78)发生了替换，共涉及4个抗原决定簇位点(A、B、C、E)，见表1。

表1 克拉玛依市H3N2流感病毒HA1区抗原位点

流感病毒HA蛋白上具有受体结合位点(RBS)，呈口袋状结构，其中5个氨基酸(98、153、183、190、194)是保守的[4-5]。与疫苗株A/Hong Kong/4801/2014比较，2018年初毒株在5个保守位点未发生变异；与疫苗株A/Kansas/14/2017比较，2019年底至2020年初毒株也未发生变异。

2.3 糖基化位点分析 疫苗株A/Hong Kong/4801/2014的HA蛋白上有12个糖基化位点，分别为NST8-10、NGT22-24、NAT38-40、NSS45-47、NCT63-65、NWT126-128、NGT133-135、NYT158-160、NVT165-167、NST246-248、NGS285-287、NGT483-485，相对疫苗株，2018年初毒株有1株(实验室编号A/Xinjiang-Karamay/48/2018)缺少NGT133-135糖基化位点。疫苗株A/Kansas/14/2017的HA蛋白上有10个糖基化位点，分别为NST8-10、NGT22-24、NAT38-40、NSS45-47、NCT63-65、NGT133-135、NVT165-167、NST246-248、NGS285-287、NGT483-485。相对疫苗株，2019年底至2020年初毒株全部缺少NGT133-135，NGT483-485 2个糖基化位点，增加NYT158-160位点。

疫苗株A/Hong Kong/4801/2014和A/Kansas/14/2017的NA蛋白上糖基化位点完全一致，为NIT61-63、NTT70-72、NWS86-88、NNT146-148、NGT234-236、NET367-369，相对疫苗株，2018-2020年所有毒株未发生任何改变。

2.4 耐药性分析 与耐药相关最常见的位点突变有E119V、R292K、H274Y等，与酶关键位点相关突变有R118、D151、R152、R224、E276、R292、R371和Y 406，本次研究未发现上述位点变异，也未发现具有稳定活性中心作用的活性周围位点突变。

3 讨 论

流感病毒之所以在人群中引起多次反复流行，是由于病毒表面的HA与NA容易产生变异导致抗原漂移和抗原转换，从而逃避宿主的免疫识别与清除，使疫苗免疫效果降低[6]。从2009年迄今，北半球已更换使用11种H3N2疫苗推荐株[7]，因此，通过分析2018-2020年流感流行期内克拉玛依市分离的H3N2病毒毒株分子遗传特征，为流感病毒的监测和早期预警提供科学依据。

从HA和NA基因进化树分析结果显示，2018-2020年克拉玛依市的流行毒株HA基因与2017-2018年北半球H3N2流感疫苗株A/Hong Kong/4801/2014较为接近，而NA基因却与2019-2020年北半球H3N2流感疫苗株A/Kansas/14/2017较为接近。目前获得许可的流感疫苗主要产生靶向病毒HA蛋白的抗体[8]。因此，对于克拉玛依市居民来说2018-2020年接种2017-2018年WHO推荐含A/Hong Kong/4801/2014成分的疫苗可能会对H3N2起到更好的抵御作用。

在流感病毒中，抗原决定簇与RBS结构上的密切关联与病毒的进化和毒力相关。本研究发现，相对疫苗株A/Hong Kong/4801/2014，2018年初毒株有1株(T180049)氨基酸位点同时在2个抗原决定簇(A、B)发生替换；相对A/Kansas/14/2017，2019年底至2020年初有7株毒株氨基酸位点同时在2个抗原决定簇(A、B)发生替换，有9株毒株氨基酸替换涉及4个抗原决定簇(A、B、C、E)。一般认为，一个新的抗原变异株的出现并有流行病学意义，要求HA1区蛋白分子有4个以上氨基酸位点发生替换，且替换必须涉及2个及以上抗原决定簇位点[9-10]。相对疫苗推荐株，克拉玛依市毒株RBS虽然未发生变异，但HA已经发生抗原漂移，可能导致疫苗免疫保护效果降低，导致流感病毒的流行。

糖基化位点分析结果表明，2018-2020年克拉玛依市流行毒株的HA蛋白均发生了糖基化位点的改变，集中在133、158和483这3个位点，且以糖基化位点消失为主；而NA蛋白未发生改变。一般认为，糖基化位点的改变或数目的增减会影响病毒的抗原性或对病毒的稳定性、传染性和致病性产生一定的影响[11]。

克拉玛依市所有H3N2毒株耐药位点均未发生突变，因此在发病早期合理使用神经氨酸酶抑制剂类药物能够有效治疗流感。2019-2020年克拉玛依市H3N2毒株与2019-2020年疫苗推荐株匹配度低于2017-2018年疫苗推荐毒株，且HA已发生抗原漂移。说明克拉玛依市H3N2流行毒株和疫苗匹配度存在降低现象，可能导致本地区H3N2毒株流行。因此，应继续加强对流感病毒HA和NA基因监测，及时筛选和更新流感疫苗，为克拉玛依市流感防控提供科学依据。

利益冲突：无

引用本文格式：刘佳，李金鞠. 2018-2020年克拉玛依市甲型H3N2流感病毒分子特征分析[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(2)：141-144，149. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.028