紫泥田水稻土细菌群落对不同农艺调控措施的响应

钟俊杰，李晓镜，尹泽润，盛浩，聂三安

（湖南农业大学资源环境学院，长沙 410128）

稻田生态系统与人类关系密切。水稻是全球最大的粮食作物，养活了超过50%的人口。我国水稻种植面积占全国耕地总面积约25%，其产量约占全国粮食产量的1/2，水稻土是具有重大经济意义的土壤资源，其生产力的稳定输出对我国粮食生产和安全至关重要。湖南省是我国水稻的重要产区，其中紫泥田水稻土是湖南省的稻田土壤类型之一，其土壤黏粒含量较高、盐基饱和度高、保水保肥能力较好、pH较低，某些地区重金属镉背景值较高。

土壤微生物是反映土壤质量的敏感性指标。土壤细菌是土壤微生物中占比最高的类群，具有繁殖周期短、数量多等特点，在土壤物质循环和能量流动的关键环节中发挥重要作用。袁红朝等发现红壤性水稻土细菌优势种群为变形菌门和放线菌门，施肥和秸秆还田提高了变形菌种群丰度，土壤pH 和有机碳是影响细菌群落结构的主要环境因子。黄泥田水稻土单施氮磷钾降低了土壤细菌数目，影响细菌群落结构的主要因子为盐度、孔隙度和总氮，而土壤pH影响较小。黄棕壤性水稻土细菌优势种群为绿弯菌门、变形菌门、放线菌门和酸杆菌门，有机肥对细菌群落α多样性影响较小，但单施化肥能提高土壤细菌群落丰富度。可见，水稻土细菌群落受施肥和有机物料的影响，但其对农艺措施改良镉污染稻田时的响应鲜有报道。

已有研究表明，镉对土壤微生物组成与多样性具有一定影响。随着土壤镉含量的增加及污染时间的延长，土壤微生物群落数量呈明显减少趋势，且高浓度镉污染显著抑制土壤微生物的生长；镉含量和活性组分对物种群落具有较大影响，土壤细菌丰度和多样性与镉污染程度呈负相关。常用调控土壤镉的农艺措施有施石灰、施肥和土壤改良技术等。石灰可提高土壤pH，增加阳离子交换能力，降低土壤中交换态镉含量；有机肥能够提高土壤有机质含量，促进土壤中的镉由交换态向其他形态（如有机态）转化；土壤调理剂能够调节土壤的物理、化学和生物学性状，活化矿质养分，进而降低镉的有效性。然而，这些农艺调控措施对紫泥田稻田土壤微生物群落结构产生何种影响及不同处理之间的差异情况还有待探索。

因此，本研究拟选择位于湖南省的紫泥田水稻土，设置石灰、有机肥和土壤调理剂3 种处理方式，研究不同农艺调控措施对紫泥田水稻土微生物群落组成、多样性及群落物种差异，并分析菌群和环境因子之间的关系，研究结果可为紫泥田水稻土肥力保育与质量演变提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地位于湖南省株洲市株洲县紫泥田典型区域，该地区地貌为湘江中游典型低丘岗地，是典型的中亚热带湿润季风气候，年平均气温17.5 ℃，年平均降雨量1 389 mm。试验地土壤由紫色板、页岩风化物发育而来，属于紫泥田土种，该土种占湖南省土壤面积的7.86%。该地区水稻种植超过50 a，长期精耕细作，种植制度为双季稻−冬闲。农田水利基础设施良好，排灌方便。试验区水稻土亚类为发育良好的潴育性水稻土，土壤剖面氧化还原交替作用强烈，土体构型为典型A−P−W1−W2型，水耕熟化度高。供试土壤试验前表层土（0~20 cm）的基本理化性质见表1。

表1 试验地0~20 cm表土的初始理化性质Table 1 Initial physiochemical properties in the studied paddy field sites（0~20 cm）

1.2 试验设计

试验始于2015年3月，在所选种植样区内选择形状较为规整的9 块稻田作为试验田，每个试验田面积0.1~0.3 hm，从中间隔开，分别设置对照组和处理组。共3 个处理，分别为商品有机肥、石灰和土壤调理剂，各处理3 次重复。有机肥采自长沙绿丰源生物有机肥料有限公司，主要原料为鸡粪（有机质含量≥45%、N+PO+KO≥5%），总镉含量0.28 mg·kg；石灰CaO含量约为76%，总镉含量0.26 mg·kg；土壤调理剂为无机型产品（N+PO+KO=8%、有效钙≥20%、有效镁≥12%），pH10~12，呈碱性，总镉含量0.25 mg·kg。在早、晚稻翻耕时，人工施撒石灰、商品有机肥和土壤调理剂，其中商品有机肥和石灰用量为2.25 t·hm，土壤调理剂用量为3 t·hm。为防止串灌，各处理修筑独立的排、灌水沟，耕作、水肥和病虫害处理方式同大田生产。早稻品种为湘早籼17 号，种植密度为35×10株·hm；晚稻品种为天优华占，种植密度为28×10株·hm。养分总投入量折算成纯N、PO和KO后分别为142.5、30.0 kg·hm和87.0 kg·hm，其中基肥施用复合肥（N∶P∶K=18∶5∶7），用量为600 kg·hm，追肥为尿素和氯化钾，均在分蘖期施用75 kg·hm。

1.3 样品采集与分析

样品采集于2020年10月，采用自制非金属土钻，采用“S”取样法，在18 个小区内采集耕层（0~20 cm）混合土壤样品，每个小区5 个采样点。土壤样品带回室内，除去土壤异物，风干后研磨，分别过10、60 目和100 目尼龙筛用于理化性质指标的测定。成熟期在各处理小区内随机选取5 个样点采集耕层（0~20 cm）的新鲜土壤带回室内，迅速剔除砾石、动植物残体等土壤异物，混匀后于冰箱（−20 ℃）中避光保存，用于土壤微生物指标的测定。

土壤相关理化性质分析参照《土壤农业化学分析方法》。其中，土壤pH 采用电位法（水土比=2.5∶1）测定；阳离子交换量（CEC）采用1 mol·L乙酸铵交换法测定；有效态镉采用DTPA 浸提，火焰原子吸收分光光度计法测定；总镉采用硝酸−盐酸−高氯酸−氢氟酸消解，石墨炉原子吸收分光光度法测定；有机碳（SOC）采用高温外加热重铬酸钾氧化−容量法测定；全氮（TN）采用凯氏定氮法测定；全磷（TP）采用酸溶−钼锑钪比色法测定；土壤全钾（TK）采用氢氧化钠熔融法测定；土壤微生物量碳（MBC）采用氯仿薰蒸−KSO（0.5 mol·L）浸提法测定。

微生物组成、多样性等指标送至北京百迈客生物科技有限公司测定。首先用PowerSoil DNA 试剂盒（MoBio Laboratories，美国）提取土壤总DNA，用80 μL DES 溶解后，通过Agarose Gel DNA 试剂盒（Takara Bio Inc，日本）进行纯化，超微量紫外分光光度计Nanodrop ND−2000 进行浓度检测。采用16S V4 区515F和806R为引物进行PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测并经GeneJETGel Extraction 试剂盒（Thermo Scientific，美国）纯化后进行文库构建，质检合格的文库用PacBio Sequel测序。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2013 处理数据，用SPSS 23.0软件进行显著性检验（Duncan法）。细菌16S rRNA指标从原始数据中导出CCS 序列进行Barcode 识别，得到有效序列；质控后的序列进行OTU 划分，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门分类学水平上的群落丰度图；通过α多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，在97%相似度水平下进行多样性指数（Ace、Chao1、Shannon 及Simpson 指数）分析；通过β 多样性分析比较不同样品在物种多样性方面（群落组成及结构）存在的差异大小。主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）通过CANOCO 5.0（Microcomputer Power，Ithaca，美 国）进 行 限 制 性 排序。高通量测序多样性指数等在百迈客生物云平台运行（www.biomarker.com.cn）。

2 结果与分析

2.1 不同农艺措施对土壤理化性质的影响

由表2 可知，不同处理与相应对照相比，仅石灰处理显著提高了土壤pH（P＜0.05）。石灰、有机肥和调理剂处理CEC、有效态镉、总镉、SOC、TN、TP、MBC无显著性差异，但石灰和调理剂处理pH 显著高于有机肥处理；调理剂处理TK 含量显著高于石灰和有机肥处理。以上结果表明，5 a 的农艺调控措施在一定程度上改变了土壤主要理化性质。

表2 不同处理土壤基本理化性质Table 2 Basic physical and chemical properties of soil under different treatments

2.2 不同农艺措施对土壤微生物群落结构的影响

2.2.1 细菌OTU丰度及多样性

由表3可知，在相同的田间管理下，各对照细菌α多样性指数具有一定的差异，说明紫泥田水稻土田块的异质性对细菌α 多样性的影响较大。各处理和相应对照之间细菌α 多样性指数均无显著差异。ACE和Chao1指数表现为有机肥＞石灰＞调理剂，且有机肥与调理剂处理之间的差异达到显著水平（P＜0.05）；有机肥和石灰处理的土壤细菌Shannon 和Simpson 指数差异不显著，但显著高于调理剂处理。以上结果表明，与对照相比，不同处理并未显著改变紫泥田水稻土细菌α 多样性，但各处理之间影响不同，田块本身的异质性是造成细菌群落α多样性差异的重要原因。

表3 不同处理土壤α多样性指数（n=3）Table 3 Soil α diversity index of different treatments（n=3）

2.2.2 土壤细菌群落组成

根据土壤样品OTU 中代表序列的物种注释结果，选取相对丰度前10 的物种（门水平）生成柱状图（图1）。石灰、有机肥和调理剂处理土壤细菌的主要菌群均为变形菌门（28.92%~43.15%）、酸杆菌门（6.40%~21.00%）、硝化螺旋菌门（5.18%~16.30%）、绿弯菌门（5.43%~16.48%）、拟杆菌门（4.03%~14.35%）和疣微菌门（4.45%~9.59%），累计相对丰度超过80%；另外还有相对丰度较低的浮霉菌门（1.61%~5.58%）、髌骨菌门（0.77%~6.28%）、芽单胞菌门（0.37%~3.48%）和己科河菌门（0.66%~2.50%）。可以发现，尽管各对照田间管理相对一致，但其土壤细菌的群落分布仍具有一定差异，说明田块本身的异质性对紫泥田水稻土细菌群落物种相对丰度的影响较大。与对照相比，有机肥和调理剂处理提高了酸杆菌门和绿弯菌门的相对丰度，但降低了变形菌门、硝化螺旋菌门及拟杆菌门的相对丰度；石灰处理提高了变形菌门、酸杆菌门和硝化螺旋菌门相对丰度，但降低了绿弯菌门和拟杆菌门的相对丰度。从不同处理方式上看，变形菌门的相对丰度排序为石灰＞有机肥＞调理剂；酸杆菌门和绿弯菌门的相对丰度排序为有机肥＞调理剂＞石灰；硝化螺旋菌门和拟杆菌门的相对丰度排序为石灰＞调理剂＞有机肥。可见，施用石灰、商品有机肥和土壤调理剂对紫泥田水稻土的细菌群落组成产生了不同影响。

图1 不同处理土壤微生物群落组成（门水平，n=3）Figure 1 Soil microbial community composition under different treatments（Phylum，n=3）

2.2.3 各处理土壤细菌群落结构的PCA聚类分析

基于OTU 分类水平，采用PCA 聚类分析研究不同处理对紫泥田水稻土细菌β 多样性的影响。根据各组对照和处理的结果（图2a），主成分1（PC1）与主成分2（PC2）对各处理土壤细菌群落差异的解释程度分别为44.27%和15.07%，合计59.34%。可以看出，尽管各对照田间管理相对一致，但其土壤细菌的群落分布仍具有一定差异，说明紫泥田水稻土细菌群落结构主要受田块本身异质性的影响。从不同处理方式上看，调理剂处理与石灰和有机肥处理差异较大，且与对照相比具有一定差异；石灰和有机肥处理较为相近，说明石灰和有机肥处理后，紫泥田水稻土细菌群落结构未发生明显变化。从对照组和处理组看（图2b），对照组和处理组细菌群落结构相差较大，说明经石灰、有机肥和土壤调理剂处理后，紫泥田水稻土细菌群落结构发生了一定的变化。

图2 不同处理土壤微生物群落结构β多样性分析结果Figure 2 β diversity analysis results of soil microbial community composition in different treatments

2.2.4 土壤细菌群落的RDA分析

由图3可知，RDA 分析中，第一排序轴（RDA1）和第二排序轴（RDA2）分别解释25.16%和6.69%的变异。蒙特卡罗检验显示，pH（=0.012）与TK（=0.028）对细菌群落结构改变效应显著（＜0.05），CEC、TP、有效态镉、TN、MBC 和SOC 对细菌群落结构改变效应不显著（＞0.05）。在第一轴上，调理剂和调理剂对照细菌群落结构与pH、TK、CEC 和TP 呈正相关关系。有机肥处理细菌群落结构土壤理化因子集中分布在第一排序轴负半轴，它们的相关性依次为有效态镉、TN、MBC 和SOC。石灰、石灰对照和有机肥对照细菌群落结构与已选取的理化因子相关性较小。由以上可知，pH 和TK 为紫泥田水稻土细菌群落结构的主要影响因子。

图3 不同处理土壤微生物群落特征与环境因子的RDA排序图（属水平，n=3）Figure 3 RDA ranking diagrams of soil microbial community characteristics and environmental factors under different treatments（Genus level，n=3）

3 讨论

3.1 不同农艺措施对土壤菌群组成、结构及多样性的影响

细菌多样性受土壤多种因素的影响。由于稻田生态系统受人为因素影响较大，田间土壤异质性在很大程度上影响了细菌α多样性。本研究中，细菌多样性分析结果表明，不同对照、对照与处理之间细菌α 多样性发生了不同程度的变化，但总体上有机肥和调理剂处理提高了细菌α 多样性。施用有机肥调控土壤pH 和可利用碳/氮源，在一定程度上能够提高土壤微生物对碳源的利用能力，提高其代谢多样性，进而提高细菌α 多样性。土壤调理剂中的有机质可为微生物生命活动提供能源物质，也会影响微生物的代谢活动。本研究发现施用石灰降低了细菌α 多样性。石灰本身对土壤具有一定的灭菌作用，且提高土壤pH 也可能会对原有微生物的生长造成影响；同时，长期施入石灰加速土壤有机质分解，腐殖质不易积累，致使土壤结构变坏，造成土壤板结，从而对微生物的生长不利。因此，不同农艺调控措施对紫泥田水稻土细菌群落多样性的影响不同，且受田块异质性影响较大。

高通量测序表明，3 种处理紫泥田水稻土细菌主要为变形菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和疣微菌门，这些是供试紫泥田水稻土的优势菌群，这与刘昌等对黄泥土的研究结果相似，说明这些细菌在土壤养分循环过程中发挥重要作用。有机肥和调理剂处理中绿弯菌门的相对丰度高于对照，原因可能是有机肥和调理剂的输入增加了土壤有机质含量，有利于绿弯菌门的繁殖。王立夫等研究表明变形菌门丰度与pH 呈正相关，绿弯菌门丰度与pH 呈负相关。兰玉书等发现施用石灰降低了绿弯菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度。本研究发现，石灰处理变形菌门相对丰度有所提高，而有机肥和调理剂处理变形菌门相对丰度低于对照，可能原因是有机肥和调理剂处理提高了SOC 含量，而较高SOC 含量提高了某些微生物与变形菌门的竞争，从而不利于变形菌门的生长和繁殖。然而，石灰处理SOC 增加较少，且土壤pH 显著增加，较高的pH 可能有利于变形菌门的生长。酸杆菌门在pH 较高的环境中生存困难，但本研究中3 种农艺措施处理后土壤酸杆菌门相对丰度较对照均有所提高，这很可能是因为pH 不是影响其生长的主要因素。研究发现拟杆菌门的丰度与土壤理化性质呈负相关，本研究3 种处理均一定程度上提高了土壤理化性质，拟杆菌门的相对丰度均低于对照，说明石灰、有机肥和调理剂的施入不利于拟杆菌门的生长和繁殖。主成分分析发现，农艺调控措施能够改变紫泥田水稻土细菌群落结构。添加石灰、有机肥和复合调理剂可提高土壤肥力水平，增加有机质含量，改变土壤中微生物群落结构。综上，农艺调控措施可以改变紫泥田水稻土细菌群落组成。

3.2 土壤理化性状与土壤细菌群落结构的相关性

土壤理化性质和重金属等环境因素会影响土壤微生物群落结构。本研究发现土壤pH 和TK 与细菌群落结构显著相关。相关研究也表明pH是影响土壤细菌群落的重要环境因子，土壤pH 的变化会影响某些微生物（如酸杆菌门）的生长和代谢活动。本研究中，不同处理改变了酸杆菌门的相对丰度，且有机肥处理高于石灰和调理剂处理，可能原因是酸杆菌为嗜酸菌，本研究中石灰处理和调理剂处理的pH显著高于有机肥处理，较高的pH可能在一定程度上抑制了酸杆菌门的生长。土壤TK也是影响紫泥田微生物群落结构的重要因素。有研究表明，钾含量与植烟土壤细菌群落结构显著相关，钾能够提高赤红壤微生物活性，进而改变微生物群落结构，由于不同处理钾含量差别较大（表2），进而可能对土壤微生物群落产生不同影响。

本研究着重研究石灰、商品有机肥和土壤调理剂对镉污染紫泥田水稻土细菌群落结构的影响，在一定范围内揭示了紫泥田水稻土细菌群落结构和多样性对不同处理的响应机制。基于现代的微生物分子生态学技术，如宏基因组文库技术、荧光原位杂交技术及Biolog−ECO 微平板法等将有助于深入阐明稻田微生物对农艺调控措施的响应。由于土壤系统的复杂性和异质性，对细菌与土壤关键因子的响应机制有待深入研究。

4 结论

（1）紫泥田水稻土壤细菌优势种群为变形菌门和酸杆菌门；石灰、商品有机肥和土壤调理剂处理均能提高酸杆菌门的相对丰度；石灰处理增加了变形菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度，但降低了绿弯菌门的相对丰度。

（2）3 种农艺调控措施对土壤细菌α 多样性无显著影响，但改变了细菌β多样性。施用石灰和有机肥处理的土壤细菌OTU 数目和α 多样性显著高于土壤调理剂处理。

（3）土壤pH 和全钾是影响紫泥田水稻土细菌群落结构变化的主要因子。