耐盐菌对盐胁迫下水稻种子萌发及幼苗生长的影响

刘鹏，毕江涛，罗成科，惠治兵，李文兵，肖国举，王静

（1.宁夏大学农学院，银川 750021；2.宁夏大学生态环境学院，银川 750021）

我国存在大面积盐渍土，其主要分布在东北、华北、西北内陆和长江以北沿海地区，是我国农业生产力发展的主要障碍之一。土壤盐渍化一方面造成土壤板结与肥力下降，阻碍植物吸收养分；另一方面通过渗透和离子胁迫影响植物和细胞水平的生理过程，使种子萌发受阻，叶绿素含量降低，光合作用下降，根系活力降低，能量消耗增加，从而加速植物衰老，并最终导致枯萎或死亡。当植物受到盐分胁迫时，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等保护酶将参与控制活性氧的含量，在提高植物耐盐性中发挥着重要作用。

水稻（）是宁夏的优势作物，年均种植面积8 万hm，总产量约6 亿kg，该区是全国优质粳稻的最佳生产区之一，北部引黄灌区土地平整、水资源便利、适合水稻大面积种植，但该地区降水量少、气候干旱、地下水位高、蒸发作用强烈，存在不同程度的盐渍化。因此，通过生物学措施提高水稻耐盐性，增加盐碱地水稻产量，对盐碱地开发利用具有重要意义。

土壤是巨大的微生物储存库，大量有益微生物能定植于植物根部，通过调节植物体内激素变化、诱导植物产生抗活性氧酶、促进植物中渗透保护物质增加、产生胞外多糖、调控植物体内离子平衡、诱导光合速率变化等过程提高作物耐盐性。目前，对添加外源物质提高作物抗逆性的研究已有很多，利用微生物促进种子萌发、幼苗生长和提高作物抗逆性越来越受到重视。黄瓜、紫花苜蓿、黑麦草、烟草、小麦等作物在盐胁迫下通过添加耐盐微生物提高作物耐盐性的研究较多，但在盐碱环境条件下对水稻生长发育的影响研究相对不足，且缺乏系统性。

种子萌发期是水稻在盐胁迫环境条件下生长发育过程中最脆弱的阶段，萌发期的生长状况对水稻后期的生长发育及产量至关重要。因此，本研究开展不同菌株组合对盐胁迫下水稻种子萌发及幼苗生长的影响，通过测定叶绿素、根系活力和酶活性等，筛选出促进盐胁迫下水稻幼苗生长最佳的菌株组合，初步阐述微生物诱导水稻的抗盐机理，以期为生物修复改良盐碱地提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻品种为宁粳28 号，品种审定编号为宁审稻2003004，购自宁夏回族自治区原种场。

供试菌株：4 株耐盐菌由课题组分离自宁夏盐碱土，各菌株耐盐均可达100 g·L左右，且菌株之间无拮抗作用，菌株纯化保存于宁夏大学生态环境学院环境微生物实验室，菌株名称和来源见表1。

表1 供试菌株及其来源Table 1 Test strains and sources

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液制备

菌株活化后，各取2 环分别接种于LB 液体培养基中，30 ℃、180 r·min振荡培养24 h。将培养液分装于无菌离心管中，室温条件下6 000 r·min离心15 min，收集菌体。张治振等的研究结果显示，150 mmol·LNaCl 可使15 个品种的水稻生长受到抑制，故使用150 mmol·L的无菌NaCl 溶液洗涤菌体3 次并调配成菌悬液，使吸光度OD=1.0。

1.2.2 水稻种子处理

选取适量籽粒饱满、颗粒大小相当的种子，蒸馏水清洗表面灰尘，先用10%的NaClO 溶液浸泡10 min后用无菌去离子水清洗5~8 次，再用75%酒精浸泡5 min，最后用无菌去离子水淋洗5~7 次，消毒后的水稻种子在无菌去离子水中室温浸泡24 h，备用。

1.2.3 试验设计

将铺有2 层滤纸的90 mm 的玻璃培养皿在高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌30 min，待培养皿冷却后，取30粒种子均匀摆放在培养皿中，加入10 mL菌悬液后，将培养皿放入28 ℃的光照恒温培育箱。试验共设置17个处理（表2），每个处理重复9次。T1为阳性对照处理，用无菌去离子水代替菌悬液；T2~T16 为试验处理，各培养皿均加入10 mL 菌悬液，将各菌悬液等比例混合作为组合处理液；T17 为阴性对照处理，用150 mmol·L的NaCl 溶液代替菌悬液。培养期间每2 d更换一次处理液，以保证胁迫环境不变。

表2 菌株组合设置Table 2 Strain combination settings

1.3 测定指标及方法

1.3.1 形态指标的测定

培养期间每日记录水稻种子萌发数量，以芽长达到种子长度的1/2 为发芽标准，观察记录种子的萌发情况，第4 d 统计发芽势，第8 d 统计发芽率并测定水稻幼苗的根长、芽长，计算发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、耐盐指数和相对盐害率。

种子发芽势=4 d内发芽种子数/供试种子数

种子发芽率=8 d内发芽种子数/供试种子数

种子发芽指数=∑（/）

式中：为天的发芽数；为发芽日数。

活力指数=×平均幼苗长度

幼苗长度=根长+芽长

耐盐指数=/×100式中：为盐胁迫下的萌发活力指数；为阳性对照下的萌发活力指数。

相对盐害率=（对照发芽率−处理发芽率）/清水处理发芽率×100%

1.3.2 生理指标的测定

叶绿素含量采用95%乙醇浸提−分光光度法测定：称取新鲜水稻幼芽0.2 g，剪碎放入研钵，加少量石英砂和碳酸钙及3 mL 95%乙醇研磨成匀浆，再加5 mL 95%乙醇研磨至组织变白，室温静置3~5 min 后转移到10 mL 离心管中4 000 r·min离心5 min，取上清液，用95%乙醇定容至25 mL 后在波长665 nm 和649 nm 下比色，通过吸光值分别计算叶绿素a（）和叶绿素b（）的浓度（mg·L），二者之和即为叶绿素总浓度（mg·L）。

根系活力采用乙酸乙酯浸提−TTC 还原法测定：称取根0.5 g，放入培养皿，加入0.4%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液和1/15 mol·L磷酸缓冲液的等比例混合液10 mL，使根充分浸于溶液，37 ℃暗处恒温振荡培养1 h，加入2 mL 1 mol·LHSO终止反应。取出根并吸干溶液，加4 mL乙酸乙酯和少量石英砂研磨提取三苯基甲臜（TTF）。把多次提取液合并于试管中，用乙酸乙酯定容至10 mL，于485 nm下比色，利用吸光值和标准曲线，得出TTC的还原量。

式中：为TTC 样品吸光度在标准曲线中所查到的相对应的还原量，μg；为根质量，g；为反应时间，h。

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定：将水稻幼芽洗净擦干，称取0.2 g 放入研钵，加入2 mL 10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，冰浴研磨至匀浆，再加8 mL TCA 进一步研磨，将匀浆于4 000 r·min离心10 min，取2 mL 上清液，再加2 mL 0.6%TBA溶液，混匀，沸水浴中反应15 min，迅速冷却后离心。取上清液测定450、532、600 nm下的吸光值。

MDA 含量（μmol·g）=[6.45（A−A）−0.56A]/式中：为提取液体积，mL；为植物组织鲜质量，g。

抗氧化酶活性：取新鲜水稻幼芽0.5 g，采用液氮研磨法进行研磨，研磨后的样品置于0~4 ℃预冷的0.2 mol·L、pH 7.0 的磷酸缓冲液中浸提2 h，4 ℃下6 000 r·min离心10 min，上清液可用于同时测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性的混合酶液。采用氮蓝四唑（NBT）法测定SOD 活性，以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活单位（U）；采用愈创木酚法测定POD 活性，以1 min 内A变化0.01 为1 个活性单位（U）；采用紫外分光光度法测定CAT 活性，以1 min 内吸光值A减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。上述指标均参照《植物生理学实验教程》完成，每个处理设3个重复。

1.4 数据处理

采用SPSS 26 统计分析软件对各项指标进行单因素方差分析，采用Microsoft Excel 2010 和Origin 2019软件整理数据和绘制图表。

2 结果与分析

2.1 添加耐盐菌对盐胁迫下水稻种子萌发的影响

由表3 可知，150 mmol·L的NaCl 胁迫对水稻种子萌发具有显著的抑制作用，而菌悬液的添加对盐胁迫下水稻种子萌发具有促进作用。盐胁迫下，水稻种子萌发受到抑制，其发芽势、发芽率和发芽指数均显著低于无胁迫处理（＜0.05），种子发芽率低于50%，比无胁迫处理低36.30 个百分点，发芽指数低12.08；添加不同菌悬液后，发芽势提高4.07~20.37 个百分点，发芽率提高7.04~22.96 个百分点，发芽指数提高2.34~9.18。不同菌株组合对种子萌发效果的影响存在差异，盐胁迫下T13水稻种子发芽势显著高于其他处理（＜0.05）；T13种子发芽率和发芽指数最高，其次为T16，但二者差异不显著（＞0.05），发芽率可提高约20个百分点，发芽指数可提高8左右。

表3 不同菌株组合对盐胁迫下水稻种子萌发的影响Table 3 Effects of different strain combinations on rice seed germination under salt stress

2.2 添加耐盐菌对盐胁迫下水稻种子生长的影响

2.2.1 对水稻根长和芽长的影响

由图1 可知，150 mmol·L的NaCl 胁迫导致水稻幼苗生长受到抑制，其根长和芽长显著短于无盐分胁迫（＜0.05）。耐盐菌悬液添加显著促进了幼苗根和芽的生长，T16 是促进芽和根生长效果最好的菌株组合，其次为T13 和T2，其中T16 处理后的芽长是T17的5.7 倍，说明4 株菌协作能有效减轻盐分胁迫对水稻幼苗的毒害作用，促进幼苗生长。

图1 耐盐菌对盐胁迫下水稻芽长和根长的影响Figure 1 Effects of salt−tolerant bacteria on rice bud length and root length under salt stress

2.2.2 对水稻种子活力指数的影响

与传统的发芽率相比，种子活力能反映种子在实际条件下的发芽速度和均匀性，以及幼苗的健壮生长潜力。由图2 可知，150 mmol·L的NaCl 胁迫会显著降低种子活力（＜0.05），T1 种子活力指数是T17 的6倍；微生物添加均能显著提高盐胁迫下种子活力（＜0.05），T16 效果最好，其次为T13，再次为T2，这三者之间差异显著（＜0.05），分别较T17 的种子活力指数提高了3.19 倍、2.51 倍和1.98 倍；T5 对提高种子活力影响最小，仅提高了0.38倍。

图2 不同菌株组合对盐胁迫下水稻种子活力指数的影响Figure 2 Effects of different strain combinations on rice seed vigor index under salt stress

2.2.3 对水稻种子耐盐指数和相对盐害率的影响

耐盐指数反映了种子对盐碱胁迫的耐受程度，相对盐害率反映了种子在盐胁迫下的损伤程度。由表4 可知，菌悬液添加显著提高盐胁迫下水稻种子的耐盐指数、降低相对盐害率（＜0.05），其中T16 水稻种子耐盐指数最高，其次为T13，T5的影响最小；T13相对盐害率最低，其次为T16，分别较T17 降低了79.48%和71.79%，T13与T16二者差异不显著（＞0.05）。

表4 不同菌株组合对盐胁迫下水稻种子耐盐指数和相对盐害率的影响Table 4 Effects of different strain combinations on the salt tolerance index and relative salt damage rate of rice seeds under salt stress

2.3 添加耐盐菌对盐胁迫下水稻幼苗生理特性的影响

2.3.1 对水稻幼苗叶绿素含量的影响

由图3 可知，在NaCl 胁迫下，水稻幼苗茎叶中叶绿素含量显著降低（＜0.05），多菌株组合菌悬液添加可提高叶绿素含量，且效果优于单菌株，其中T8效果最佳，其次为T16，叶绿素含量分别较T17 增加了33.75% 和31.90%，T8 和T16 二者差异不显著（＞0.05）。

图3 耐盐菌对盐胁迫下水稻幼苗叶绿素含量的影响Figure 3 Effects of salt−tolerant bacteria on the chlorophyll content of rice seedlings under salt stress

2.3.2 对水稻幼苗根系活力的影响

由图4可知，NaCl胁迫导致水稻幼苗根系活力显著降低（＜0.05），菌悬液添加可显著提高盐胁迫下水稻幼苗根系活力，但不同菌株组合对根系活力影响差异较大，其中T2 影响最大，较T17 提高12.47 倍，与T1无显著差异（＞0.05），其次为T16、T6 和T5，T14 影响最小，较T17提高了1.37倍。

图4 耐盐菌对盐胁迫下水稻幼苗根系活力的影响Figure 4 Effects of salt−tolerant bacteria on rice seedling root activity under salt stress

2.3.3 对水稻幼苗茎叶丙二醛含量及保护酶活性的影响

由图5 可知，150 mmol·LNaCl 胁迫致使水稻幼苗茎叶中MDA 含量显著升高，比T1 高49.25%，干扰了水稻的正常生命活动。加菌悬液后，叶片中MDA含量均有所降低，除T7、T12 和T15 外，其他处理均达到了显著水平（＜0.05），其中，T16效果最佳，与T1无显著差异（＞0.05），说明添加耐盐菌可以缓解盐胁迫对水稻叶片膜脂过氧化的伤害，且多菌株组合对盐胁迫的缓解作用更大。

图5 耐盐菌对盐胁迫下水稻幼苗茎叶MDA含量的影响Figure 5 Effects of salt−tolerant bacteria on MDA content of rice seedling stems and leaves under salt stress

由图6 可知，150 mmol·LNaCl 胁迫使水稻幼苗CAT 活性降低，但与T1 差异不显著。不同菌悬液添加对盐胁迫下水稻幼苗CAT 活性影响不同，T2、T6使CAT 含量显著降低（＜0.05），T3、T4、T8、T9、T13、T16使CAT 含量显著升高（＜0.05），其中T13 较T1 提高了74.38%。

图6 耐盐菌对盐胁迫下水稻幼苗茎叶CAT活性的影响Figure 6 Effects of salt−tolerant bacteria on CAT activity of rice seedling stems and leaves under salt stress

由图7 可知，150 mmol·LNaCl 胁迫能使水稻幼苗POD 活性显著降低，添加菌悬液能够显著提高POD 活性，但不同菌株组合对POD 活性影响差异较大。T9 较T17 提高1.43 倍，与T1 无显著差异（＞0.05），T5 和T14 使盐胁迫下水稻幼苗POD 活性分别较T17降低了25.98%和31.94%。

图7 耐盐菌对盐胁迫下水稻幼苗茎叶POD活性的影响Figure 7 Effects of salt−tolerant bacteria on POD activity of rice seedling stems and leaves under salt stress

由图8 可知，150 mmol·LNaCl 胁迫能使水稻幼苗SOD 活性显著升高，除T5、T6 和T9 外，其他添加菌悬液处理均能够显著提高盐胁迫下水稻幼苗中SOD活性（＜0.05），但不同组合对SOD 活性影响差异较大，T11 对盐胁迫下幼苗SOD 活性影响最大，较T17可提高1倍以上。

图8 耐盐菌对盐胁迫下水稻幼苗茎叶SOD活性的影响Figure 8 Effects of salt−tolerant bacteria on SOD activity of rice seedling stems and leaves under salt stress

3 讨论

3.1 耐盐菌对盐胁迫下水稻种子及幼苗的影响

植物能否在盐碱地上生长取决于其种子在盐分胁迫条件下能否萌发成苗，当土壤中含盐量超过0.3%时，水稻发芽就会受到抑制，出现叶尖焦枯、老叶死亡等现象。随着NaCl 浓度的升高，水稻种子发芽势、发芽率、萌发指数呈递减趋势。多项研究显示，盐胁迫条件下添加有益微生物可以有效降低盐胁迫、促进植物生长发育，枯草芽孢杆菌GB03菌液浸泡紫花苜蓿种子可以显著提高盐胁迫下发芽势与发

芽率，对株高和根长及生物量均有不同程度的提升作用，接种于土壤可直接或间接调节盐胁迫下白三叶草的叶片渗透势，细胞膜完整性和离子积累。Fan等从盐碱地植物根际分离出具有溶磷、产IAA 等促生功能基因的节杆菌（）和巨大芽孢杆菌（），两菌株可以提高盐胁迫下番茄种子的发芽率、幼苗高度、活力指数以及植物的鲜质量和干质量。武珈亦等的研究结果显示，在0.3%的NaCl 胁迫下，荧光假单胞菌（）与巴西固氮螺菌（）菌液按1∶1 混合接入水稻根际，可显著提高水稻剑叶光合速率、生物量、分蘖能力、结实率和千粒质量。在本研究中，150 mmol·L（质量分数约0.9%）的NaCl显著抑制了水稻种子萌发及幼苗生长，将枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌及阿氏芽孢杆菌菌悬液单独或等比例混入盐溶液，各处理均能有效促进盐胁迫下水稻种子萌发、种子活力、耐盐指数、幼苗生物量，耐盐性有所增加，相对盐害率显著降低，另外，多菌株组合促生效果总体上优于单菌株，但菌株不同组合之间对盐胁迫下水稻促生效果存在差异，其原因有待进一步研究。

植物光合作用是受盐胁迫影响的生理过程之一。高等植物的色素主要是由叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素组成，光合色素含量减少是光合作用效率降低的一个主要原因。盐浓度越高、作用时间越长，对光合作用影响越大。韩庆庆等和武珈亦等接种菌株，在促进盐胁迫下植物生长的同时也增加了其叶绿素含量，提高了光合作用速率。本研究中，单菌株添加对盐胁迫下水稻叶绿素含量影响较小，但多菌株组合不同程度提高了盐胁迫下水稻幼苗叶绿素含量。

根系作为植物重要的吸收代谢器官，是植物在土壤盐渍化中最直接的受害部位，也是生长受抑制最早和最明显的部位。根系活力反映了根系的代谢能力，直接影响植物的生长和抗逆性。随着盐浓度的增长，水稻、罗布麻、小麦、番茄等作物的根系活力均受到抑制；添加荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌可以提高烟草和黑麦草根系活力。本研究中，盐胁迫显著降低了水稻幼苗根系活力，加入菌悬液后根系活力显著提高，其中枯草芽孢杆菌效果最好，枯草芽孢杆菌自身合成的α−淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类和多种B 族维生素可与植株体内的酶协同发挥作用，促进植物生长发育，但在菌株复配后其效果有所降低，可能与菌株之间相互作用有关。对于盐胁迫条件下微生物参与提高水稻根系活力的机理还有待进一步研究。

高浓度盐会使植物细胞膜受到损伤，产生大量的MDA，同时体内活性氧大量积累，SOD、CAT、POD 是植物体内酶促防御系统的3 个重要保护酶，这3 种酶协同作用以控制植物体内自由基的含量，减轻细胞膜系统的损伤。在低浓度盐胁迫下，幼苗可通过提高保护酶活性减轻盐害，但这种能力不会随盐浓度增加而持续增强，当盐浓度过高时，保护酶活性就会降低。不同基因型的同种作物在盐胁迫下的酶活性变化也可能不同。80 mmol·L盐胁迫下，水稻SOD、POD 和CAT 活性增强，MDA 含量增加。本研究中，水稻种子在150 mmol·LNaCl 胁迫下，MDA 含量和SOD 活性显著上升，但POD 活性显著下降，CAT活性无显著变化，这可能是盐浓度差异造成的。CHEN 等的研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌SQR9可能会通过总可溶性糖（TSS）含量增加而减轻对细胞的破坏，提高CAT 和POD 活性，降低Na毒性，提高玉米耐盐性，促进玉米幼苗生长；韩冰等的研究结果显示，接种丛枝菌根真菌AMF 可提高SOD、POD 和CAT 活性，降低MDA 含量，缓解芦笋盐胁迫。本研究中各微生物处理与不加微生物处理相比，幼苗MDA含量均有所下降，大多处理的CAT、POD 和SOD 活性有不同程度提高，且多菌株混合在提高SOD 活性中具有较好的效果。各菌株对酶活性影响具有一定的差异性，菌株复配后各处理间差异较大可能与菌株间的相互作用有关。

3.2 菌株在盐胁迫下水稻种子萌发及幼苗生长中的作用

枯草芽孢杆菌和多黏类芽孢杆菌是兼具生防和促生功能的菌株；苏云金芽孢杆菌常被用作杀虫剂，阿氏芽孢杆菌是2009 年分离出的新种，能够提高植物对金属离子、干旱、病害的抗性，二者均对植物具有一定的促生作用。本研究中枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌3 株菌组合提高了盐胁迫下种子发芽率、发芽指数和CAT 活性，显著降低了盐胁迫下种子相对盐害率，效果优于4 株菌组合，这在某种程度上说明复合菌种类数越多其效果不一定越好。枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌组合能显著提高种子活力指数、耐盐指数，促进幼苗和根系生长，显著降低盐胁迫下水稻幼苗MDA 含量。苏云金芽孢杆菌在提高种子发芽率、发芽势和幼苗CAT 活性方面效果优于多黏类芽孢杆菌，但提高SOD 活性效果不如多黏类芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌在盐胁迫下种子萌发、幼苗生长、提高幼苗CAT 活性和降低MDA含量方面具有较强的相似性，但在提高根系活力方面枯草芽孢杆菌效果更为突出，在提高幼苗SOD 活性方面阿氏芽孢杆菌效果更优。菌株不同量、不同组合对盐胁迫下植物的促生效果不同，可根据植物生长需求对菌株进行配比。

4 结论

在150 mmol·LNaCl溶液中，耐盐芽孢杆菌可以显著提高水稻种子发芽率、增加幼苗叶绿素含量、提高根系活力和抗氧化酶活性，促进幼苗生长，多菌株复配效果优于单菌株，但不同菌株组合的功能存在一定差异，可根据植物生长需求进一步优化菌株配比。