海带岩藻聚糖的无乙醇提取工艺研究

陈艳红，董玉婷，啜鹏杰，陈石乔昕，姜泽东,3,4, ，朱艳冰,3,4，倪 辉,3,4，邓尚贵，李清彪,3,4

（1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建厦门 361021；2.华侨大学实验室与设备管理处，福建泉州 362021；3.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021；4.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门 361021；5.浙江兴业集团，浙江舟山 316014）

海带（Laminaria japonica）是一种大型的可食用褐藻，营养丰富、口感良好，素有“长寿菜”和“海上之蔬”的美誉。多糖是海带中最主要的生物活性成分之一，主要分为三种：褐藻胶、褐藻淀粉、岩藻聚糖[1-2]。岩藻聚糖（Fucoidan），又称褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖胶等，是一种细胞间质多糖[3]。国内外学者已对岩藻聚糖进行了深入研究，阐明了其基本结构特征和生物活性。岩藻聚糖的多糖骨架主要由岩藻糖（Fucose）和硫酸基团构成，此外还含有半乳糖、甘露糖、木糖等[4]。随着岩藻聚糖的有益生物活性及其机理不断被阐释，包括抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、抗病毒、调控肠道菌群和抗过敏等[5-10]，其在生物医药和食品领域的开发利用也受到越来越多的关注。目前，岩藻聚糖被欧盟批准为新食品原料，也获得了美国食药局（FDA）的 GRAS认证；在亚太地区，日本一直占据岩藻聚糖研究和产品开发的主要地位，广泛运作于功能食品、医药品、营养补充品以及普通食品领域。

岩藻聚糖的制备工艺中最常用的是热水浸提-乙醇沉淀法，还有酸浸提和碱浸提等提取方法[5]。近年来，超临界萃取、酶辅助提取、微波或超声辅助提取等方法被广泛应用于海藻多糖的制备工艺的研究和应用[6]。目前，这些方法中酸/碱浸提、酶辅助提取、微波或超声辅助提取等往往会破坏天然多糖的结构[5]。热水浸提-乙醇沉淀法工艺相对简单，对设备和场地的要求不高，并且可最大限度保留多糖的天然结构，适用于规模化生产[5]。另外，上述各种方法所制备的多糖提取液都需要经过乙醇分级沉淀才能获得岩藻聚糖。乙醇分级沉淀是利用褐藻酸、昆布多糖和岩藻聚糖在不同浓度乙醇中溶解性的差异对岩藻聚糖进行提纯的方法[1]；通过50%～70%的乙醇沉淀，可以从海带提取上清液中制备获得初级纯化的岩藻聚糖[7]。因此，在目前的岩藻聚糖的制备工艺流程中均需要使用大量的乙醇。例如，陈东慧等[5]报道的热水浸提法制备岩藻聚糖工艺，制备1 g初级多糖制品需要使用95%的乙醇约3.2 L。乙醇的大量储备和使用给岩藻聚糖生产带来了严重的安全隐患和巨大的经济负担。基于此，本研究拟利用岩藻聚糖中岩藻糖和硫酸基团的含量及其有益生物活性为指标，针对传统的岩藻聚糖的热水浸提-乙醇沉淀制备工艺进行改进和优化，旨在获得高品质和生物活性岩藻聚糖的无乙醇沉淀提取工艺，丰富海藻多糖提取加工和高值利用的理论基础，为岩藻聚糖安全、高效地规模化生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海带L.japonica采集于福建漳州东山岛海带养殖海域，晾干备用；标准单糖：L-岩藻糖（L-Fuc）美国 Sigma 公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）阿拉丁试剂（上海）有限公司；蛋白胨、LB培养基广东环凯微生物科技有限公司；酵母粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；褐藻胶裂解酶10000 U/g 西格玛奥德里奇（上海）有限公司；其它试剂均为分析纯产品。

HH-4型恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台 苏州净化设备有限公司；5810R型冷冻高速离心机 德国 Eppendorf公司；FE20 型pH计 梅特勒-托利多称重设备系统有限公司；BioTek Cytation-5细胞成像多功能检测系统美国伯腾仪器有限公司；ZHWY-2102/ZWY-200D型双层全温度培养摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；1360 Infinity超高压高效液相色谱仪（配有可变波长紫外检测器和Inert Sustain RC18色谱柱）中国安捷伦科技有限公司；iS50 FT-IR红外光谱仪中国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 岩藻聚糖的制备工艺 岩藻聚糖的制备采用了三种工艺，分别是热水浸提-乙醇沉淀法、热水浸提-酸沉法、热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法。

热水浸提-乙醇沉淀法[8]： 将海带清洗干净放入烘箱干燥后粉碎过筛（60目），加入混合液（乙醇:三氯甲烷:水= 4:2:1）进行预处理，于 4 000 r·min-1离心10 min得到沉淀将其烘干，加入热水浸提，浸提结束后离心取上清液，在上清液中加入60%乙醇沉淀岩藻聚糖粗多糖，于4 000 r·min-1离心15min得到沉淀，用纯水清洗沉淀再加入0.5 mol/L NaCl清洗去除褐藻胶，继续离心得到沉淀，用95%～100%乙醇清洗沉淀后干燥获得岩藻聚糖（样品1）。

热水浸提-酸沉淀法：参照文献[8]所报道的方法，去除最终乙醇分级沉淀岩藻聚糖步骤。方法如下：将海带清洗干净放入烘箱干燥后粉碎过筛（60目），加入热水浸提，浸提结束后于4 000 r·min-1离心10 min 取上清液加入盐酸将pH调制1.4后高速离心（10000 r·min-1, 10 min），离心分离褐藻胶，取上清液调节pH至中性，将上清液放入透析袋中透析，透析结束后冷冻干燥获得岩藻聚糖（样品2）。

热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法：参照文献[8]，将海带清洗干净放入烘箱干燥后粉碎过筛（60目），加入热水浸提，浸提结束后于4 000 r·min-1离心10 min取上清液加入盐酸将pH调制1.4后离心分离褐藻胶（10000 r·min-1，10 min），取上清液调节 pH 至中性后加入褐藻胶裂解酶（5 U/mL）50 ℃处理3 h（去除褐藻胶），酶解结束后放入水浴锅中高温灭酶，将上清液放入透析袋中透析，透析结束后冷冻干燥获得岩藻聚糖（样品 3）。

岩藻聚糖得率按以下公式计算：

岩藻聚糖得率（%）=岩藻聚糖质量/海带粉质量×100

1.2.2 总糖含量的测定 岩藻聚糖中总糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定[9]。岩藻聚糖烘干至恒重，配制10 mL浓度为1 mg/mL的多糖溶液。向1 mL样品溶液和各标准溶液中加入1 mL苯酚溶液（6%），摇匀后，加入浓硫酸5 mL后迅速混匀，冷却至室温，在490 nm 波长下测定吸光度值。以葡萄糖为标准品，以葡萄糖浓度为横坐标x，以吸光度值为纵坐标y，绘制标准曲线，得到线性回归方程为：y=0.0365x+0.0951（R2=0.9997），据此计算样品中总糖含量。

1.2.3 岩藻糖含量的测定 采用柱前PMP衍生法[10]衍生单糖标准品（L-Fuc）和多糖的水解产物，通过高效液相色谱（HPLC）法[10]对样品中单糖岩藻糖组分进行定量分析。将4 mg/mL多糖溶液（或不同浓度单糖标准品溶液）与等体积的4 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液混匀后，100 ℃沸水浴4 h。冷却至室温后，加入1600 μL甲醇，进行真空旋转蒸发，重复三次去除TFA。旋蒸后的样品用800 μL蒸馏水溶解。向水解样品中加入0.6 mol/L的等体积NaOH溶液混匀，加入1.6 mL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液并混匀，70 ℃水浴100 min。冷却至室温后，加入1.6 mL 0.3 mol/L的HCl溶液中和，混匀后进行旋转蒸发。向样品中加入800 μL的蒸馏水和800 μL的三氯甲烷，涡旋振荡后离心去除有机相；上述步骤重复三次以充分去除溶液中未反应的PMP。获得的水相经过0.22 μm微孔膜过滤后，进行HPLC分析。

HPLC分析条件如下：液相柱，Inert Sustain RC18色谱柱（4.6 mm I.D.×75 mm）；柱温，30 ℃；流速，1.0 mL/min；进样体积，50 μL；紫外检测器波长，250 nm；洗脱液，0.2 mol/L PBS-乙腈溶液（乙腈为17%，pH=8.9）。

以单糖标准品的浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=4280.1x-60.238（R2=0.9993），据此测定样品中各单糖组分的含量。

1.2.4 硫酸基团含量的测定 岩藻聚糖中硫酸基团的含量采用氯化钡-明胶比浊法测定[11]。准确称取明胶0.5 g溶解于50 mL蒸馏水中，4 ℃过夜后加入0.5 g氯化钡，静置2 h获得明胶-氯化钡溶液，过0.45 μm滤膜备用。多糖在1 mol/L HCl溶液中105 ℃水解4 h，随后加入1 mL明胶-氯化钡溶液，充分摇匀后，在波长500 nm处测定吸光值。使用K2SO4作为标准品，以浓度为横坐标x，吸光值为纵坐标y，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0011x+0.1218（R2=0.9991），据此测定样品中硫酸基团（）质量分数。

1.2.5 蛋白质含量的测定 岩藻聚糖中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[12]。将1 mL浓度为0.1 mg/mL的岩藻聚糖溶液与考马斯亮蓝溶液以1:4的比例混匀，室温放置10 min，在波长为595 nm处测定吸光值。使用BSA作为标准品，以BSA浓度为横坐标x，吸光度值为纵坐标y绘制标准曲线，获得线性回归方程为 y=0.0004x+0.1097（R2=0.9991），据此计算样品中蛋白质含量。

1.2.6 糖醛酸含量的测定 岩藻聚糖中糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法测定[13]。在冰浴条件下，向1 mL浓度为1 mg/mL的岩藻聚糖溶液中加入5 mL的四硼酸钠-硫酸溶液，待温度降至室温后，再加入0.15%的咔唑-乙醇溶液，摇匀。沸水浴20 min后，冷却至室温，在波长为523 nm处测定吸光值。使用D-葡萄糖醛酸作为标准品，以D-葡萄糖醛酸浓度为横坐标x，吸光度值为纵坐标y绘制标准曲线，得到线性回归方程为 y=0.3333x+4E-16（R2=1.000），据此计算样品中糖醛酸含量。

1.2.7 傅立叶红外光谱分析 将岩藻聚糖样品烘干至恒重，分别称取1.5 mg与KBr混合，研磨均匀后压成半透明薄片，置于iS50 FT-IR红外光谱仪中，在4000～400 cm-1波长处进行检测，记录红外光谱图。

1.2.8.1 抗氧化活性分析 岩藻聚糖的抗氧化活性采用还原力、OH 自由基（OH·）、ABTS+自由基（ABTS+·）以及DPPH自由基的清除能力进行评价。

采用铁氰化钾还原法[14]测定岩藻聚糖的还原力。取0.30 mL不同浓度的岩藻聚糖溶液，分别加入0.35 mL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6.6）和0.35 mL的 K3Fe（CN）6溶液（1%，w/v），混匀后，50 ℃ 水浴20 min。冷却至室温后，加入0.35 mL的三氯乙酸溶液（10%，w/v）和 0.15 mL 的 FeCl3溶液（0.1%，w/v），混匀。在波长为700 nm处测定吸光值A1。对照组为蒸馏水代替样品测得的吸光值为A0。按照公式（1）计算岩藻聚糖的还原力，如下：

参照WANG等[15]所述的方法测定OH·清除能力。分别在离心管中按顺序加入0.1 mL不同浓度的岩藻聚糖溶液、0.1 mL的水杨酸乙醇溶液（9 mmol/L）、0.1 mL的 FeSO4溶液（9 mmol/L）、0.1mL的 H2O2（8.8 mol/L）和0.6 mL去离子水，混匀，于37 ℃水浴反应10 min。在波长为510 nm处测定吸光值A1。对照组为蒸馏水代替样品测得的吸光值为A0。按照公式（2）计算岩藻聚糖对OH·清除率，并计算出岩藻聚糖的半数清除率（IC50）。计算公式如下：

参照YANG等[16]所述方法测定 ABTS+·清除能力。分别取0.1 mL的不同浓度岩藻聚糖溶液与1 mL的ABTS工作液混合后，在734 nm处测定吸光值A1。对照组为蒸馏水代替样品测得的吸光值为A0。按照公式（3）计算岩藻聚糖对ABTS+·清除率，并计算出岩藻聚糖的半数清除率（IC50）。计算公式如下：

参照LV等[17]所述方法测定DPPH自由基清除能力。分别取0.8 mL不同浓度的岩藻聚糖溶液和0.8 mL的DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），混匀，室温下避光保存0.5 h，在波长517nm处测定吸光值A1，对照组为蒸馏水代替多糖样品测得的吸光值为A0，计算多糖样品的DPPH自由基清除率，计算公式（4）如下：

1.2.8.2 抑菌活性分析 岩藻聚糖对大肠杆菌的抑菌活性采用比浊法[18]测定。不同浓度的岩藻聚糖溶液经0.22 μm滤头过滤除菌，备用。取4 mL不同浓度的岩藻聚糖溶液与4 mL的LB培养基混合，岩藻聚糖的终浓度分别为 0、2、4、6、8、10 mg/mL。取20 μL细菌悬液，接种到含多糖的LB培养基中，混匀，在37 ℃的恒温摇床中培养12 h，转速为180 r/min。最终在波长600 nm处测定细菌悬液的吸光值A1。以无菌水替代多糖样品为阴性对照组测得吸光值A0，阳性对照组为以卡那霉素替代多糖样品。按照公式（5）计算岩藻聚糖对大肠杆菌的抑制活性，如下：

1.2.9 基于响应面法优化热水浸提-酸沉淀-酶解辅助提取岩藻聚糖工艺 热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法提取得到的岩藻聚糖的品质（岩藻糖和硫酸基团含量高）和生物活性较好。因此，基于单因素实验和Box-Benhnken 中心组合实验设计原理[19]，以提取过程中的关键因素为响应值设计实验，利用Design-Expert 8.0.5软件对热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法提取岩藻聚糖的工艺过程进行优化。

1.2.9.1 单因素实验 以提取温度、提取时间、液料比为因素，以岩藻聚糖得率为考察指标，考察3个因素对岩藻聚糖得率的影响。

由于共享经济属于新事物，正处于快速发展阶段，相关政府尚未出台相应的法律法规，对其发展的监管仍存在许多灰色地带。现阶段，仍有投机分子利用这些漏洞，破坏市场秩序而相关部门也因无法可依，不能及时处理一些违法现象，导致共享经济发展存在小范围恶性循环。

提取温度对岩藻聚糖提取率的影响：固定液料比（40:1 mL/g）和浸提时间（2.0 h），考察浸提温度在70、80、90及100 ℃条件下对岩藻聚糖提取率的影响。

提取时间对岩藻聚糖提取率的影响：固定液料比（40:1 mL/g）和浸提温度（90℃），考察浸提时间在1.0、2.0、3.0及4 h条件下对岩藻聚糖提取率的影响。

液料比对岩藻聚糖提取率的影响：固定浸提温度（90 ℃）和浸提时间（2.0 h），考察液料比（mg/L）在30:1、35:1、40:1及45:1条件下对岩藻聚糖得率的影响。

1.2.9.2 响应面优化试验 在单因素实验基础上，采用Design Expert 8.0.6 Box-Behnken试验设计方案，其因素与水平设计见表1。实验因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken试验因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.3 数据处理

为确保实验的准确性和数据的可靠性，上述每组实验进行三次独立实验并重复3次。实验结果用Office 2016、SPSS 19.0和 Design-Expert 8.0.6进行处理分析，P＜0.05代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同制备工艺对岩藻聚糖得率的影响

基于文献所报道的热水浸提-乙醇沉淀法最佳工艺条件制备获得的岩藻聚糖样品1的得率为5.87%±0.23%；热水浸提-酸沉法制备获得的岩藻聚糖样品2得率为9.65%±0.11%；在热水浸提-酸沉法得到样品2的基础上，采用褐藻胶裂解酶处理，对样品进一步进行纯化（热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法），所得岩藻聚糖得率为6.67%±0.46%。在这三种制备方法中，热水浸提-乙醇沉淀法利用乙醇分级沉淀，分别得到岩藻聚糖和褐藻胶，而热水浸提-酸沉法和热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法均是利用褐藻胶不溶于稀酸溶液的特性，沉淀得到褐藻胶；热水浸提-乙醇沉淀法制备岩藻聚糖的副产物褐藻胶得率为6.88%±0.15%，热水浸提-酸沉淀法和热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法褐藻胶得率为10.14%±0.07%。结果表明，热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法制备岩藻聚糖得率高于传统的热水浸提-乙醇沉淀法，通过酸沉法得到褐藻胶得率明显高于醇沉法得到褐藻胶得率。

2.2 不同制备工艺对岩藻聚糖化学组成的影响

针对不同工艺制备的岩藻聚糖的化学组成包括总糖、单糖岩藻糖、硫酸基团、蛋白质和糖醛酸含量进行分析，测定结果如图1所示。结果表明，3种样品中，样品3通过热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法制备的岩藻聚糖样品总糖含量（图1A）最高，为68.22%±1.31%，显著（P＜0.05）高于行业标准（SC/T 3404-2012）要求的50%；如图1B所示，样品3单糖岩藻糖含量（41.10%±0.87%）也高于样品 1（32.10%±0.31%）和样品2（36.70%±0.28%），并且显著高于行业标准（SC/T 3404-2012）要求的15%；同样地，热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法制备的岩藻聚糖样品的硫酸基团含量（24.90%±0.15%）相比通过工艺一和工艺二制备的岩藻聚糖样品的硫酸基团含量（21.10%±0.14%和22.10%±0.09%）显著（P＜0.05）提高（图1C），符合行业标准（SC/T 3404-2012）要求的15%；另一方面，样品3的蛋白质含量和糖醛酸含量均低于样品1和样品2，分别降低至6.50%±0.04%和3.80%±0.01%，表示热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法更有利于蛋白质和糖醛酸的脱除。结果表明，不同制备工艺的岩藻聚糖样品化学组成含量差异显著（P＜0.05），热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法制备的岩藻聚糖样品品质（岩藻糖和硫酸基团含量高）相对优于热水浸提-乙醇沉淀法和热水浸提-酸沉法。

图1 不同工艺制备岩藻聚糖的化学组成Fig.1 Chemical composition of fucoidan prepared by different processes

2.3 不同制备工艺对岩藻聚糖结构特征的影响

岩藻聚糖样品1、样品2、样品3的红外光谱图如图2所示。由图2可知，不同工艺制备的3个样品均在3500～3300 cm-1处出现红外特征吸收峰，这是糖类物质共有的O-H的伸缩振动信号；2900 cm-1处的吸收峰为C-H伸缩振动的信号；在1650和1400 cm-1附近出现的吸收峰是C=O的伸缩振动引起的[7,20]。在1260 cm-1处的吸收峰为S=O的吸收峰，同时，3个多糖样品在1260 cm-1处均有较强的吸收峰，表明其均含有硫酸基团[21]。位于1150 cm-1和1080 cm-1处吸收峰分别为C-O-C和C-OH的特征峰[22-23]。以上结果表明，不同工艺制备的3种多糖样品的具有相似的官能团结构特征。

图2 三种岩藻聚糖样品的红外光谱图谱Fig.2 FT-IR spectroscopy infrared spectra of three fucoidan samples

2.4 不同制备工艺对岩藻聚糖抗氧化活性和抑菌活性的影响

不同制备工艺对岩藻聚糖抗氧化活性的影响如图3所示。结果表明，在多糖浓度为0～10 mg/mL范围内，3种岩藻聚糖的还原力随着多糖质量浓度的升高而增强，相同浓度条件下多糖对Fe3+的还原力大小依次为样品3＞样品2＞样品1（图3A）；在0～10 mg/mL的测试浓度范围内，岩藻聚糖对OH自由基、ABTS+自由基和DPPH自由基的清除能力均随着多糖的质量浓度的增大而增强；样品1、样品2、样品3对OH自由基的半数清除浓度（IC50）分别为8.99、6.45、4.72 mg/mL（图3B），对ABTS+自由基的半数清除浓度（IC50）分别为 7.90、5.24、3.61 mg/mL，对 DPPH自由基的半数清除浓度（IC50）分别为5.22、2.61、1.25 mg/mL（图3C～7D）。研究表明，岩藻聚糖的抗氧化活性受多糖的提取方法和分子量、糖苷键类型、硫酸基团含量及位置等结构因素的影响[24]。WANG等[25]研究了海带中低分子量岩藻聚糖的抗氧化活性，发现硫酸基团含量与抗氧化能力之间呈正相关性，本研究结果与上述报道一致。另外，谢瑾等[26]发现用胰酶和木瓜蛋白酶酶解岩藻聚糖可显著酶解产物的抗氧化活性，是由于酶自身催化活性及酶解位点不同，使得水解后的多糖分子量大小和分子结构存在差异，因此表现出不同的抗氧化能力。样品3表现出较强抗氧化活性的确切原因还需要进一步研究。

图3 岩藻聚糖抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of fucoidan

岩藻聚糖对大肠杆菌的抑制效果如图4所示。在所测试浓度（0～10 mg/mL）范围内，岩藻聚糖样品1、样品2、样品3对大肠杆菌的抑制能力随着多糖的质量浓度的增大而增强，其抑菌活性与多糖的浓度呈正相关。相同质量浓度条件下三种不同制备工艺制备的岩藻聚糖的抑菌活性强弱依次为样品3＞样品2＞样品1，表明相比传统的热水浸提-乙醇沉淀法，热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法制备的岩藻聚糖的抑菌活性最佳。研究表明，岩藻聚糖的抑菌活性不仅取决于多糖的分子量以及硫酸基团含量，还主要受到多糖中单糖的构成和比例及其分子构象等多重因素的影响[25]。本研究中，通过工艺三制备的岩藻聚糖其岩藻糖和硫酸基团的含量显著高于通过工艺二和工艺一制备的岩藻聚糖，并且样品1、样品2和样品3的抑菌活性随着所含的岩藻糖和硫酸基团的含量增多而增强，推测通过工艺三制备的岩藻聚糖具有较好的抑菌活性归因于其含有较高含量的岩藻糖和硫酸基团。

图4 岩藻聚糖对大肠杆菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of fucoidans on Escherichia coli

2.5 热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法提取岩藻聚糖工艺优化

2.5.1 单因素实验结果 固定液料比（40:1 mL/g）和浸提时间（2.0 h），考察浸提温度对岩藻聚糖提取得率的影响。随着浸提温度的上升，岩藻聚糖得率逐渐升高；当温度为90 ℃时，其得率达到最大；温度继续升高，其得率呈现急剧下降的趋势（图5A）。这是因为一定范围内提高浸提温度会加速海藻组织软化膨胀，促进组织内分子运动，加速多糖的扩散，提高浸提效果[27]；当浸提温度过高，则导致多糖的结构破坏和降解损失，从而致使岩藻聚糖得率降低[28]。因此，选取90 ℃为最适浸提温度进行后续试验。

固定液料比（40:1 mL/g）和浸提温度（90 ℃），考察浸提时间对岩藻聚糖提取得率的影响。在上述最适提取温度条件下，浸提时间为1.0～2.0 h 时，随时间延长岩藻聚糖提取得率呈上升趋势，2.0 h 时达到最大提取得率；浸提时间超过2.0 h 后，多糖得率随时间增长逐渐下降（图5B）。这是因为90 ℃条件下，浸提时间过长也会破坏多糖的结构，使多糖被降解，从而导致岩藻聚糖得率降低[29]。另外，浸提时间的延长还会使生产能耗增大。因此，选取2.0 h为浸提酶解时间进行后续试验。

将浸提温度和时间分别设置为上述最适条件（90 ℃和2.0 h），考察液料比对岩藻聚糖提取得率的影响。结果如图5C所示，液料比在30:1 ～ 40:1 mL/g时，岩藻聚糖的提取得率随液料比增大逐渐升高。研究表明增加多糖提取溶剂中水的比例可有效降低多糖溶液的黏度，从而提高提取体系中多糖溶质的浓度差，在一定程度上提高传质推动力，可有效促进多糖分子的传质扩散[30]。因此，在本实验中随着浸提体系的液料比逐渐增大，岩藻聚糖得率逐渐升高。当液料比高于40:1 mL/g 时，岩藻聚糖得率无显著提高，因为海藻中大部分多糖已被浸提出来，因此增大提取溶剂中水的比例也不会导致多糖得率显著提升[30]。另一方面，液料比过高会增加多糖生产制备过程中的水耗和加热能耗，增大产品的生产成本。因此，选取40:1 mL/g为最优液料比进行后续试验。

图5 单因素实验结果Fig.5 Single factor experimental results

2.5.2 响应面试验结果 采用Design-Exper 8.0.6 软件对表3的数据进一步进行回归分析，得到响应值与实验因素三元二次回归方程：

Y=-225.24050+4.03141X1+2.07975X2+2.46483X3-0.0065X1X2-0.006665X1X3-0.019500X2X3-0.020776X12-0.16838X22-0.021805X32

用Design-Expert 8.0.6 软件分析模型的可信度，模型的决定系数R2=0.9961,R2Adj=0.9912,R2接近于1，表明模型对响应值的预测准确，可将模型应用于实验的分析与预测。

2.5.3 二次模型的方差分析结果 根据表1因素水平的选取和表2 的结果，用Design-Expert 8.0.6 软件进行方差分析，该模型和模型系数的显著性检验结果如表3所示。实验获得的模型为高度显著水平（P＜0.0001），失拟项P=0.057，表明模型的纯误差不显著。一次项中浸提温度（X1）、浸提时间（X2）和料液比（X3）对岩藻聚糖得率影响均显著（P＜0.05）；其中X1和X3对岩藻聚糖的提取得率影响达极显著水平（P＜0.01），X3对其得率影响最大。二次项中 X1和X3对岩藻聚糖得率影响极显著（P＜0.01）；交互项中X1X3对岩藻聚糖得率影响极显著（P＜0.01），而X1和 X2、X2和 X3之间交互影响不显著（P＞0.05）。综上，研究表明三因素中对岩藻聚糖得率影响水平大小依次为液料比＞温度＞时间，其中液料比为极显著水平，温度（℃）和液料比的交互作用也达到了极显著水平。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression model

2.5.4 响应面因素间的交互作用分析 进一步评价提取过程中关键影响因素的交互作用对岩藻聚糖提取得率的影响，分别绘制了各因素交互作用影响的响应曲面和等高线，如图6所示。图6A是浸提时间与浸提温度的交互作用对岩藻聚糖得率的影响，响应面发生了弯曲，表明浸提时间与浸提温度对岩藻聚糖得率的影响不是简单的线性关系，浸提温度对岩藻聚糖得率的影响大于浸提时间的影响，两个因素的交互作用对响应值影响不显著。同样，图6B中响应面也发生了弯曲，表明料液比和浸提时间与岩藻聚糖得率也不是简单的线性关系，进一步优化得到液料比对岩藻聚糖得率的影响大于浸提时间的影响，同时两个因素的交互作用不显著。从图6C可以看出液料比与浸提温度之间的交互作用显著，以上结果与表3 回归方程方差分析结果一致。

图6 各因素交互作用对提取率影响的等高线和响应面图Fig.6 Contour and response surface maps of the interaction of various factors on the extraction rate

2.5.5 响应面模型的验证 应用响应面法优化，基于Design-Expert 8.0.6 软件分析得到热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法提取岩藻聚糖的最佳工艺条件为：浸提温度为94.78 ℃、浸提时间为1.96 h、液料比为41.13 mL/g，在此参数下岩藻聚糖得率最高为9.34%。根据实际操作条件，将优化后的浸提温度调整为90 ℃，浸提时间为2.0 h，液料比为40 mL/g，进行验证性实验，获得岩藻聚糖提取率为9.65%±0.11%，与预测值的相对误差为2.32%，相对误差值较小，表明回归模型与实验结果相符合，回归方程能准确地反映浸提温度、时间以及液料比对岩藻聚糖提取得率的影响，模型具有可行性。

3 结论

通过对三种方法提取得到的岩藻聚糖进行的一系列研究表明，热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法所制得的样品3具有最佳的品质以及最好的生理活性。样品3的得率为6.67%±0.46%，总糖含量为68.22%±1.31%，岩藻糖含量为41.10%±0.87%，硫酸基团含量为24.90%±0.15%，蛋白质含量为6.50%±0.04%，糖醛酸含量为3.80%±0.01%，得到副产物褐藻胶得率为10.14%±0.07%。抗氧化力实验结果表明，三种样品的抗氧化活性强弱依次为样品3＞样品2＞样品1。抑菌实验结果表明，三种样品抑制大肠杆菌的活性强弱依次为样品3＞样品2＞样品1，进一步说明热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法提取岩藻聚糖可以作为一种有效替代热水浸提-乙醇沉淀法提取岩藻聚糖的良好工艺。本研究进一步利用响应面法对热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法提取岩藻聚糖工艺中关键因素进行优化，获得了岩藻聚糖最佳工艺参数，浸提温度为90 ℃，浸提时间为2.0 h，液料比为40:1 mL/g，岩藻聚糖得率达到9.65%±0.11%。本研究中热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法的岩藻聚糖提取得率及其所制备的岩藻聚糖的生物活性显著高于热水浸提-乙醇沉淀法、热水浸提-酸沉淀法制备的岩藻聚糖，热水浸提-酸沉淀-酶解辅助法有望在今后成为一种有效替代热水浸提-乙醇沉淀法提取岩藻聚糖的良好工艺，该工艺提高岩藻多糖提取率和品质的同时消除了乙醇带来的安全隐患。