遏蓝菜硒蛋白的纯化、结构表征及抗氧化活性研究

向安妮，许 爽，鞠红梅，赵诗宇，岳田利,2，袁亚宏

(1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100；2.西北大学 食品科学与工程学院，西安 710069)

硒是维持人体健康必需的微量营养素，在自然界中以无机硒和有机硒两种形态存在。无机硒主要包括硒化物、硒酸盐和亚硒酸盐，有机硒主要包括硒多糖、硒代氨基酸、硒多肽和硒蛋白等[1]。硒的功能与其赋存形态相关，有机硒比无机硒能更好地被人体吸收且毒性更低[2]。硒蛋白被认为是硒生理活性发挥的主要存在形式[3]，具有抗氧化、提高免疫力和抗肿瘤等多种功效[4]。其中，硒蛋白的抗氧化功效被广泛研究，已有关于茶叶硒蛋白[5]、平菇硒蛋白[6]和大米硒蛋白[7]等抗氧化活性的报道。在自然界中，无机硒可通过植物转化为安全性好和生物利用度高的有机硒，因此，研究植物中的硒蛋白具有重要意义。

从植物中提取硒蛋白的常见技术包括浸提、酶水解和超声提取等。酶法提取蛋白反应条件温和，能够避免酸碱提取蛋白带来的负面影响，且能更多地保留蛋白质的营养价值[8]；超声波则能加速提取的进程[9]。提取的蛋白常含许多小分子杂质，为了使蛋白在分析应用中具有较高的纯度，有必要使用色谱技术对蛋白进行分离纯化。常用的色谱技术为阴离子交换色谱法。样品中的杂质在流经交换柱时被吸附，所需成分被洗脱下来从而达到纯化的目的。DEAE-Sepharose FF是一种将琼脂糖凝胶与二乙胺基乙基键合形成的一种弱阴离子交换介质，因其流动性优异，被广泛用于蛋白的分离[10-11]。光谱技术包括荧光光谱、核磁共振光谱(NMR)、圆二色谱、红外光谱(FT-IR)和紫外可见光谱(UV-vis)等，通常用来表征蛋白结构。它们可以深入解析蛋白质的三维结构，探索蛋白质分子之间形成的互补结构，以及蛋白与其他物质结合的构象变化[12]。此外，透射电子显微镜 (TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜 (AFM)和超分辨率显微镜 (SRM)等常被用来探测蛋白的微观形貌[13]。

遏蓝菜(ThlaspiarvenseL.)又名菥蓂、败酱草等，在中国南方大部分地区多见，常生长于路旁、山坡和田边等处。古时人们常食用遏蓝菜度荒充饥。目前,关于遏蓝菜的研究多集中在研究其栽培技术[14-17]、种子油理化性质[18]和累积重金属的机理[19-21]。邵树勋等[22]在湖北渔塘坝硒矿区的调查中，发现遏蓝菜是一种硒超富集植物。然而，目前对遏蓝菜有效成分的结构和生理活性的研究鲜有报道，限制了其资源的开发和利用。为改变这一状况，本研究以遏蓝菜为原料，通过超声波辅助酶法提取硒蛋白，将其纯化后对其结构及抗氧化活性进行研究，旨在为遏蓝菜资源的综合利用提供试验依据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

遏蓝菜样品(50 kg)于2019年夏季从中国湖北省恩施市新塘镇双河鱼塘坝的人工种植基地采收。DEAE-Sepharose FF购自上海源叶生物科技有限公司；透析袋购自北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝G-250、盐酸、氢氧化钠和氯化钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 遏蓝菜用水洗净，将其根、茎和叶放置在50 ℃烘箱中干燥48 h，粉碎后过80目筛得遏蓝菜根、茎和叶等不同部位的干粉。将不同部位干粉用石油醚(料液比1∶10)脱色脱脂30 min，静置澄清，倾出上层石油醚，重复此过程3～5次。后置于烘箱中烘干，储存于干燥器中备用。

1.2.2 遏蓝菜各部位蛋白含量和硒含量的测定 取遏蓝菜不同部位的干粉各5 g，加入100 mL蒸馏水，50 ℃水浴振荡提取4 h；4 500 r/min离心15 min，取上清液；采用考马斯亮蓝G250法测定各部位干粉上清液中的蛋白含量，并用原子荧光光谱法(AFS)对各部位干粉上清液中的硒含量进行测定[23]。

1.2.3 4种含硒蛋白的提取 选取遏蓝菜蛋白得率及含硒量均较高部位的干粉，进行蛋白的分级提取，并分析不同蛋白组分的蛋白含量及硒含量[24]。

遏蓝菜水溶性含硒蛋白的提取：首先，按 1∶20(W/V)的比例将样品与蒸馏水混合，50 ℃水浴震荡提取4 h，将提取液以4 500 r/min离心15 min，取上清液并收集残渣1；往上清液中加入w=80%的硫酸铵溶液沉淀蛋白，4 ℃下过夜，离心(4 500 r/min，15 min)取沉淀。沉淀用去离子水透析(截留分子质量3.5 ku)72 h以除去杂质，冻干后得水溶性含硒蛋白。

遏蓝菜盐溶性含硒蛋白的提取：将残渣1按1∶20(W/V)的比例与0.5 mol/L的NaCl溶液混合，后续实验操作与水溶性含硒蛋白的提取一致，最后得到残渣2和盐溶性含硒蛋白。

遏蓝菜醇溶性含硒蛋白的提取：将残渣2用蒸馏水洗涤2～3次后，按1∶20(W/V)的比例与75%乙醇混合，后续实验操作参照水溶性含硒蛋白的提取，沉淀蛋白前，先通过40 ℃减压蒸馏以除去上清液中的乙醇，最后得到残渣3和醇溶性含硒蛋白。

遏蓝菜碱溶性含硒蛋白的提取：将残渣3用蒸馏水洗涤2～3次后，按1∶20(W/V)的比例与0.1 mol/L的NaOH溶液混合，后续实验操作与水溶性含硒蛋白的提取一致，最后得到碱溶性含硒蛋白。

1.2.4 超声辅助酶法提取硒蛋白 采用超声辅助酶法提取遏蓝菜中蛋白纯度和硒含量均较高的粗硒蛋白。取遏蓝菜干粉5 g，加入酶(1%酶添加量，纤维素酶∶果胶酶=6∶4)及超纯水100 mL，50 ℃超声(300 W)辅助提取60 min。离心(6 000 r/min，10 min)得上清液，后续试验操作与沉淀水溶性含硒蛋白的方法一致，沉淀经透析、冻干后得粗硒蛋白。

1.2.5 硒蛋白的纯化 使用蛋白纯化仪[25](AKTA Purifier 100，General Electric，瑞典)和DEAE-Sepharose FF层析柱对粗硒蛋白进行纯化。将粗硒蛋白20 mg溶于10 mL去离子水中，加入1% H2O2溶液于40 ℃下反应1 h以脱色，结束后将样品溶液冷却至室温过0.22 μm水性滤膜。将滤液加样于DEAE-Sepharose FF层析柱，以含0、0.2、0.4、0.6和0.8 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲盐(pH 8.0，25 mmol/L)作为洗脱液，控制洗脱速度为1 mL/min，每5 min收集一管。以对应梯度的缓冲盐为空白，于280 nm处检测洗脱液的紫外吸收值并绘制洗脱曲线。收集单一峰位洗脱组分，去离子水透析(截留分子质量3.5 ku)72 h，浓缩、冻干以备用。

1.2.6 硒蛋白的光谱分析 将纯化后的蛋白组分溶于去离子水中，配制成0.5 mg/mL的溶液，采用紫外分光光度计(UV-2550，Shimadzu，日本)测定样品在190～800 nm的紫外吸收光谱。并用压片法制备红外光谱仪(FT-IR)测量所用的样品，即将样品(1 mg)与KBr粉末(100 mg)混合后压片，采用FT-IR(Vetex70，Bruker，德国)在 400～4 000 cm-1下进行分析。

1.2.7 氨基酸组成分析 硒蛋白水解氨基酸含量的测定参照GB 5009.124-2016食品安全国家标准进行，即将氨基酸标准品及样品溶于浓盐酸溶液(6 mol/L)中水解，采用全自动氨基酸分析仪(L-8900，Hitachi，中国)进行分析。

1.2.8 扫描电镜分析 根据尹仁文等[26]的方法，取适量的样品放置于导电胶上，固定后喷金，采用场发射扫描电子显微镜(Nano SEM-450，FEI，美国)对样品形貌进行观察和拍照。

1.2.9 抗氧化活性测定 DPPH自由基清除活性：采用Teng等[27]的方法，测定硒蛋白清除DPPH自由基的活性。将各蛋白组分配制成不同浓度(2、4、6、8和10 mg/mL)的溶液。取0.5 mL样品溶液和150 μL 0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液混合，避光孵育30 min。以维生素C溶液作阳性对照，于517 nm处测量吸光度。计算硒蛋白清除DPPH自由基的能力：

式中，A0为150 μL DPPH-乙醇溶液和0.5 mL水的吸光度；A1为150 μL乙醇和0.5 mL样品溶液的吸光度；A2为150 μL DPPH-乙醇溶液和0.5 mL样品溶液的吸光度。

羟基自由基清除活性：采用水杨酸法[28]测定硒蛋白清除羟基自由基的活性。将不同浓度(2、4、6、8和10 mg/mL)的样品溶液、硫酸亚铁溶液(20 μL，9 mmol/L)、水杨酸(20 μL，9 mmol/L)溶液和过氧化氢溶液(20 μL，20 mmol/L)混合，于37 °C下孵育30 min。以维生素C溶液作阳性对照，于510 nm处测量吸光度。计算硒蛋白清除羟基自由基的能力：

式中，A2为无水乙醇代替水杨酸乙醇测得的反应体系的吸光度；Ac为去离子水代替样品溶液测得的反应体系的吸光度；A1为样品溶液的吸光度。

超氧自由基清除活性：在96孔板中，将150 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液、10 μL 3 mmol/L邻苯三酚溶液和40 μL样品溶液(2、4、6、8和10 mg/mL)混合。以维生素C作阳性对照，5 min内每隔30 s在325 nm处测量反应体系的吸光度。计算硒蛋白的超氧自由基清除率：

式中，K0为空白管(蒸馏水代替样品)的吸光度变化的斜率；K1为样品管吸光度变化的斜率；K10为背景管(盐酸代替邻苯三酚)吸光度变化的斜率。

总还原力测定：采用铁氰化钾比色法[29]测定硒蛋白的总还原力。取样品溶液(2、4、6、8和10 mg/mL)4 mL与1 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 6.6)及1 mL 1%铁氰化钾溶液混合，置 50 ℃水浴加热20 min，冷却后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液混合并振荡。4 000 r/min离心5 min得上清液，取2 mL上清液和2 mL蒸馏水及0.4 mL三氯化铁溶液混合，于50 ℃水浴加热10 min。以维生素C作阳性对照在700 nm处测定吸光度，吸光度越高表示硒蛋白的还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 硒蛋白的提取

遏蓝菜不同部位干粉中蛋白含量和硒含量：遏蓝菜各部位干粉的蛋白含量和硒含量如表1所示，可见各部位蛋白含量为叶>茎>根，硒含量为叶>根>茎，表明硒和蛋白均在叶部位累积。这可能是由于植物根部通过硫酸盐转运蛋白从土壤中吸收无机硒后，无机硒从根部迅速转移到叶片中，在叶绿体中转化为有机态硒[30]，使得植物叶部位的硒蛋白含量最多。

表1 遏蓝菜不同部位中的蛋白含量和硒含量Table 1 Protein content and selenium content in different positions of Thlaspi arvense L.

粗硒蛋白制品的蛋白含量和硒含量：取硒含量和蛋白含量均较高的叶部位为原料进行蛋白的分级提取，采用考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量，AFS法测定硒含量。如表2所示，4种蛋白粗制品的蛋白含量和硒含量的次序均为：碱溶性含硒蛋白>水溶性含硒蛋白>盐溶性含硒蛋白>醇溶性含硒蛋白。但是由于碱法提取的硒蛋白品质较差[31]，所以在后续试验中采用水溶性含硒蛋白提取法进行提取。为了提高硒蛋白的得率，在水提法的基础上设计超声辅助酶提法，发现超声辅助酶法提取的蛋白得率为3.75%，比热水浸提法(得率仅为0.33%)提高3.42%，表明超声辅助酶法能显著提高蛋白得率。综上，本研究采用超声辅助酶法提取遏蓝菜叶中的水溶性含硒蛋白，具有较高的含硒蛋白得率，所得硒蛋白品质较好，在后续的纯化和表征试验中均以此法提取遏蓝菜含硒蛋白。

表2 4种粗硒蛋白制品的蛋白含量和硒含量Table 2 Protein content and selenium content in four crude selenoproteins

2.2 硒蛋白的纯化

硒蛋白洗脱曲线如图1所示，蛋白粗品经DEAE-Sepharose FF层析柱洗脱后得到5个级分(PSP-1、PSP-2、PSP-3、PSP-4、PSP-5)。其中，PSP-2和PSP-3的吸光值比较高，提示它们的蛋白含量比较高。因此，选取这两个级分进行后续AFS硒含量检测，检测结果表明PSP-2和PSP-3级分的含硒量分别为2.456 μg/g和2.569 μg/g。

图1 PSP在DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱上的色谱图Fig.1 Anion-exchange chromatogram of PSP on DEAE-Sepharose FF

2.3 氨基酸组成分析

由表3可知，PSP-2和PSP-3级分分别由15种不同的氨基酸组成，包含6种必需氨基酸，且必需氨基酸含量占比高，说明PSP-2和PSP-3氨基酸种类齐全、组成合理。其中亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和异亮氨酸合并的含量较高，这4种氨基酸合并量分别占PSP-2和PSP-3氨基酸总量的42%和34%。这4种氨基酸可参与机体对蛋白质代谢的调控，与人体肝脏功能密切相关[32]。因此，遏蓝菜硒蛋白具有作为保肝产品原料的潜力。

表3 PSP-2和PSP-3的氨基酸组成与含量Table 3 Composition and content of amino acids of PSP-2 and PSP-3

PSP-2和PSP-3氨基酸成分的评分：为了进一步分析遏蓝菜硒蛋白的营养价值，依照关海宁等[33]的方法，将PSP-2及PSP-3的必需氨基酸含量与联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)提出的理想蛋白质中对应氨基酸参考值[34]作比较，得到表4所示结果。可知，PSP-2的含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)的氨基酸评分最高，PSP-3的缬氨酸与酪氨酸的氨基酸评分最高。另外，根据FAO/WHO推荐的模式，E/T比应不少于0.40，E/N比值应不少于0.60，PSP-2及PSP-3的E/T和E/N比值均高于上述标准 (表3)。说明遏蓝菜硒蛋白的必需氨基酸模式接近FAO/WHO的推荐模式，具有较好的营养 价值。

表4 PSP-2和PSP-3的氨基酸评分Table 4 Hydrolyzed amino acid score in PSP-2 and PSP-3

2.4 紫外光谱分析

PSP-2和PSP-3的紫外扫描图谱如图2所示。PSP-2在240 nm附近的吸收峰和PSP-3在260 nm附近的吸收峰来源于两种蛋白中所含的肽键[35]，两个峰的强度均较高，提示两种样品均含有较多的肽键，且PSP-2中的肽键更多。280 nm附近的吸收峰对应PSP-2和PSP-3中芳香族氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)中存在的共轭双键吸收区[36]。以上两处的吸收峰证明了纯化后的样品主要成分为蛋白质。另外，PSP-2和PSP-3在350 nm附近有一较弱肩峰，源于蛋白中二硫键的吸收。二硫键具有稳定蛋白分子肽链空间结构的能力，从图2可以看出此肩峰强度较小，说明PSP-2和PSP-3中二硫键数目少[37]，结构不稳定。

图2 PSP-2和PSP-3的紫外扫描光谱Fig.2 UV scanning spectra of PSP-2 and PSP-3

2.5 红外光谱分析

PSP-2和PSP-3的红外图谱如图3所示。两组分在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带均有明显的特征峰，说明遏蓝菜硒蛋白具有典型的蛋白红外光谱特征。其中，3 400～3 440 cm-1的吸收峰对应蛋白酰胺A带的特征峰，PSP-2和PSP-3的酰胺A带在 3 408 cm-1及3 412 cm-1处，由N-H的伸缩振动引起。

图3 PSP-2、PSP-3和Na2SeO3的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of PSP-2,PSP-3 and Na2SeO3

1 690～1 630 cm-1对应于蛋白酰胺Ⅰ带的吸收峰，由C=O的伸缩振动引起，PSP-2和PSP-3的酰胺Ⅰ带在1 622 cm-1及1 628 cm-1处，吸收峰发生蓝移，可能是由于硒与蛋白结合所致。 1 650～1 590 cm-1对应于蛋白酰胺Ⅱ带的吸收峰，主要由-COO-的伸缩振动导致，PSP-2和PSP-3的酰胺Ⅱ带在1 468 cm-1处，吸收峰发生蓝移，证明PSP-2和PSP-3的肽链中存在氢键[38]。 1 335～1 200 cm-1对应于蛋白酰胺Ⅲ带的吸收峰， PSP-2和PSP-3的酰胺Ⅲ带在1 298 cm-1与 1 294 cm-1处，由C-N伸缩振动引起。此外，3 018 cm-1附近对应PSP-2和PSP-3酰胺B带的C-H的特征峰，1 067 cm-1及1 063 cm-1处的峰对应于PSP-2和PSP-3中氨基的特征峰。

在Na2SeO3红外光谱中(图3)，746 cm-1处的吸收峰为Se=O特征峰。而在PSP-2和PSP-3红外光谱中， 775 cm-1与773 cm-1处的峰分别对应于Se=O特征峰，推测这可能是蛋白中其他官能团影响的结果。另外，PSP-21067cm-1处的峰和PSP-3 1 063 cm-1处的峰分别对应于O-Se-O键[39]。这些结果进一步证实硒化蛋白存在于PSP-2和PSP-3中。

2.6 扫描电镜分析

PSP-2和PSP-3在不同放大倍数下的SEM图(图4)显示：在8 000倍的放大倍数下，硒蛋白呈现出碎片和大小不一聚集体的表面形态，聚集体表面有不规则的凸起结构；在 30 000倍的放大倍数下，硒蛋白具有球状结构，球状表面凹凸不平。以上观察结果表明遏蓝菜硒蛋白结构不稳定，易于通过氢键和疏水作用形成复杂的空间结构[40]。另外，SEM结果显示有大量表面光滑的小碎片分布在PSP-2及PSP-3中，这些碎片的产生可能是超声处理所致，因为超声波产生的较高的剪切力和空化作用会引起蛋白质解折叠[41]，导致蛋白质的颗粒尺寸减小[42]。SEM结果还显示两种蛋白组分的球状结构中都存在孔洞，推测该孔洞为硒与蛋白结合的位点[43]。上述SEM观察结果从微观形貌方面证明了PSP-2及PSP-3中存在含硒蛋白。此外，PSP-2中小片段之间连接松散，而与PSP-2片段相比则PSP-3连接比较紧密，这种蛋白表面形貌的差异可能与它们具有不同的生物活性有关。

图4 PSP-2(A：8 000×;B:30 000×)和PSP-3(C:8 000×;D:30 000×)的扫描电镜图Fig.4 Scanning electron micrographs of PSP-2(A：8 000×;B:30 000×) and PSP-3(C:8 000×;D:30 000×)

2.7 硒蛋白的抗氧化活性

PSP-2和PSP-3的抗氧化活性的检测结果(图5)显示：随着样品浓度的不断提高，PSP-2和PSP-3的抗氧化活性也随之增加。在4个体外抗氧化试验中，当样品浓度均为10 mg/L时，PSP-2和PSP-3的DPPH自由基清除率分别为52.79%和51.09%，羟基自由基清除率分别为68.61%和86.52%，超氧自由基清除率分别为40.53%和42.84%，总还原力检测在700 nm处的吸光度为0.33和0.18。表明PSP-2和PSP-3具有较强的自由基清除能力和总还原力。在测试范围内的同一质量浓度下，PSP-2的DPPH自由基清除能力和总还原力略强于PSP-3，而羟基自由基清除能力和超氧自由基清除能力略弱于PSP-3。

A.PSP-2和PSP-3对DPPH自由基的清除能力； B.PSP-2和PSP-3对羟基自由基的清除能力； C.PSP-2和PSP-3对超氧阴离子自由基的清除能力； D.PSP-2和PSP-3的还原力作用曲线

对比两种蛋白含硒量及抗氧化活性，可得出蛋白含硒量越高，其羟基自由基和超氧自由基清除能力越强的结论。胡振瀛等[44]研究发现灵芝硒蛋白的超氧自由基和羟基自由基清除能力随蛋白硒含量的增加而增强，杜明等[45]研究发现富硒菜籽粕蛋白比普通菜籽粕蛋白具有更强的抗氧化活性，均与本研究结果基本一致。此外，有研究报道蛋白的抗氧化活性与其疏水性氨基酸的含量密切相关。由氨基酸分析可知，PSP-2的疏水性氨基酸含量多于PSP-3的疏水性氨基酸含量，这可能是PSP-2的DPPH自由基清除能力及总还原力强于PSP-3的原因。

3 结论与讨论

深入研究和开发硒蛋白，具有重要意义。中国是缺硒大国，约有72%的地区缺硒[46]，发现和研究富硒食品和其他补硒剂对于提高国民身体健康水平具有格外重要的作用。硒蛋白是有机硒的主要载体，膳食中的硒蛋白在十二指肠发生水解，被机体吸收。因此，深入研究硒蛋白的生物学特性，开发更多适合人体利用的硒蛋白产品，将有助于促进国民身体健康水平的提高。硒蛋白是微量元素硒发挥其生物活性的主要功能形态，具有多种功效。研究和开发具有优良生物学活性的硒蛋白，对相关疾病的防治将具有积极的作用。综上，硒蛋白具有食补和药用两方面的价值，具有良好的市场潜力，对其进行深入研究十分重要。遏蓝菜的元素富集功能，使得对其与硒补充和硒利用关联的研究显得更为重要。研究表明在遏蓝菜中，硒主要以有机硒形式赋存，蛋白硒是主要的赋存状态。但是，遏蓝菜硒蛋白的性状和特性如何，至今仍没有相关报道，亟待深入研究。

本研究以遏蓝菜为原料，获得具有较高营养价值及优良抗氧化能力的硒蛋白。并证明遏蓝菜硒蛋白既可以作为绿色植物硒补充剂，应用于食疗保健领域，也具有作为抗氧化剂应用于相关疾病防治的潜力。总体而言，研究结果对遏蓝菜资源的合理深加工和改良具有促进作用，也为进一步研究遏蓝菜硒蛋白的构效关系以设计出具有强大抗氧化活性的定制富硒蛋白提供了基础。