响应面法优化大白桩菇液体发酵工艺

王志伟，郭 尚，侯雷平，李艳婷

（1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

大白桩菇（Leucopaxillusgiganteus）又名大青蘑、雷蘑、青腿子或竹菇[1]，隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌目（Agricales）白蘑科（Tricholomataceae）白桩菇属（Leucopaxillus）[2]。大白桩菇不仅味道鲜美、营养价值丰富[3]，还可治小儿麻疹、烦燥不安等[4]。此外，研究大白桩菇多糖、蛋白质、杯伞素等生物活性物质，发现其具有清除过量自由基、提高免疫功能、抗肿瘤活性等生物学功能[5-6]。

大白桩菇是台蘑的代表种类之一[7]，近年来，由于当地居民的过度采摘，其产量面临着逐年缩减的威胁；另外，由于大白桩菇生长周期长、驯化难度大，目前尚未实现人工栽培。王谦等[8]研究发现，大白桩菇菌丝生长的最适温度为25~26℃，最佳pH值为5~6，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为尿素。利用液体发酵获得蘑菇菌丝体是一种简便、快捷的方法，其具有发酵周期短、方法简单、易于控制、成本低等特点[9]。王永斌等[10]对大白桩菇液体发酵条件进行了优化，结果表明，大白桩菇最佳深层发酵条件为：培养温度28℃，培养时间9 d，摇床转速140 r/min。有研究表明，液体培养得到的菌丝体和农业生产得到的蘑菇子实体（菌核），在化学组成和生理功能上相似[11]。这些研究为大白桩菇的开发利用提供了有价值的参考，但对其培养过程中不同培养条件下活性物质积累的研究鲜有报道。

本试验通过对大白桩菇液体发酵过程中不同碳源、氮源、碳氮比、p H影响其菌丝体干质量及活性物质的积累研究，以期为大白桩菇的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试大白桩菇菌株由山西农业大学山西功能食品研究院提供。

1.2 仪器设备

SM 830立式压力蒸汽灭菌器（重庆雅马拓科技有限公司）；SW-CJ-2D超净工作台（上海茸研仪器有限公司）；GXZ-1000A光照培养箱（宁波乐电仪器制造有限公司）；0.000 1 g电子天平（瑞士梅特勒托利多）；移液枪（德国艾本德公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（盐城市安信实验仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化与液体菌种的制备 将大白桩菇菌种接种于固体培养基（培养基配方：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，维生素B110 mg/L）在24℃下暗培养20 d。采用打孔器挑取直径为0.5 cm已培养好的菌种置于液体培养基（培养基配方：葡萄糖30 g/L，蛋白胨6 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.25 g/L，维生素B110 g/L）中，培养温度25℃，摇床转速150 r/min，避光培养15 d，作为菌种备用。

1.3.2 单因素试验 利用5种碳源（葡萄糖（C1）、海藻糖（C2）、蔗糖（C3）、麦芽糖（C4）、乳糖（C5））代替液体培养基中的碳源，配制培养基。按5%的接种量接入液体菌种，24℃、130 r/min振荡培养10 d，终止培养。用尼龙布（0.10 mm）分离菌丝体和发酵液，菌丝体通过蒸馏水冲洗3次，60℃烘干至恒质量，称量记录；发酵液置于4℃冰箱中保存，用于后续试验。以不添加碳源的培养基为空白对照（C6），每种配方设3个重复。

利用5种氮源（蛋白胨（N1）、牛肉浸膏（N2）、酵母粉（N 3）、硫酸铵（N4）、麸皮（N5））代替液体培养基中的氮源，配制培养基，以不添加氮源的培养基为空白对照（N6），每种配方设3个重复。

以葡萄糖（含碳量40%）为碳源、蛋白胨（含氮量16%）为氮源，在其他成分不变的条件下，通过调整蛋白胨的含量使其碳氮比分别为2.5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，每种配方设3个重复。

以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源，在其他成分不变的条件下，通过调整培养基的pH值，使其pH值分别为4、5、6、7、8、9，每种配方设3个重复。

1.3.3 菌丝体提取液的制备 将干燥后的菌丝体研磨至0.25 mm，精确称质量0.5 g，加入20倍体积的水，设置温度80℃，在超声波中提取1 h，5 000 r/min离心10 min，取上清液，即为水提液，重复提取，合并2次的水提液。沉淀物加入20倍体积的无水乙醇，设置温度60℃，在超声波中提取1 h，5 000 r/min离心10 min，取上清液，即为醇提液，重复提取，合并2次的醇提液。

1.3.4 成分测定 总糖含量采用苯酚-硫酸法测定；还原糖含量采用DNS法测定[12]；总黄酮含量采用AlCl3-NaNO2法测定[13]；总酚含量采用福林酚法测定[14]。

粗多糖含量=总糖含量－还原糖含量 （1）

1.3.5 响应面优化液体培养试验 在单因素试验的基础上，分别选取碳源（海藻糖）、氮源（牛肉浸膏）、p H这3个因素为考察对象，以菌丝体干质量为响应值，利用Design-expert 8.0软件设计3因素3水平试验，每个试验设置3个重复，如表1所示。

表1 响应面试验设计Tab.1 The test design of response sur face

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2013软件和SPSS Statistics 22统计软件对数据进行处理和分析；采用Design-expert 8.0进行响应面试验设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碳源对大白桩菇菌丝体干质量及活性成分含量的影响 由图1可知，液体发酵过程中，不同的碳源对大白桩菇菌丝体干质量及活性成分的含量均有明显的影响。与对照相比，5种碳源均能提高大白桩菇的菌丝体干质量，其中，海藻糖是菌丝体干质量积累的最佳碳源，菌丝体干质量为5.17 g/L，其次为葡萄糖和蔗糖。葡萄糖有利于菌丝体多酚物质的积累，水提物中多酚含量为8.15 mg/g，醇提物中多酚含量为0.92 mg/g，其次为蔗糖和麦芽糖，这与BARROS等[15]的研究结果一致；以葡萄糖为碳源的发酵液中多酚含量最高，为1.10 mg/mL，其次为麦芽糖，二者间无显著性差异。蔗糖有利于菌丝体黄酮物质的积累，水提和醇提物中黄酮总含量为4.76 mg/g，以蔗糖为碳源的发酵液中黄酮含量最高，为0.83 mg/mL，其次为海藻糖。以蔗糖为碳源的菌丝体中粗多糖的含量最高，为232.24 mg/g，其次是海藻糖，为217.90 mg/g。碳源对大白桩菇菌丝体的积累及活性成分的含量影响不一，因此综合各指标可推断，液体培养中海藻糖是菌丝体干质量积累的最佳碳源，葡萄糖是菌丝体多酚积累的最佳碳源，蔗糖是菌丝体黄酮和粗多糖积累的最佳碳源。

2.1.2 氮源对大白桩菇菌丝体干质量及活性成分含量的影响 由图2可知，液体发酵过程中，不同的氮源对大白桩菇菌丝体干质量及活性成分的含量均有明显的影响。与对照相比，5种氮源均能提高大白桩菇的菌丝体干质量，其中，牛肉浸膏和硫酸铵能显著提高大白桩菇菌丝体干质量，二者间无显著性差异，其次为蛋白胨。蛋白胨有利于菌丝体多酚物质的积累，水提物中多酚含量为9.24 mg/g，醇提物中多酚含量为2.22 mg/g。以硫酸铵为氮源的发酵液中多酚含量最高，为1.57 mg/mL，其次为酵母粉，多酚含量为1.47 mg/mL。蛋白胨有利于菌丝体黄酮物质的积累，水提和醇提物中黄酮总含量为4.71 mg/g，以酵母粉为氮源的发酵液中黄酮含量最高，为1.09 mg/mL，其次为硫酸铵，黄酮含量为1.04 mg/mL。以蛋白胨为氮源的菌丝体中粗多糖的含量最高，为173.05 mg/g，其次是硫酸铵，为139.45 mg/g。氮源对大白桩菇菌丝体的积累及活性成分的含量影响不一，因此综合各指标可推断，牛肉浸膏是菌丝体干质量积累的最佳氮源，蛋白胨是菌丝体活性成分积累的最佳氮源。

2.1.3 碳氮比对大白桩菇菌丝体干质量及活性成分含量的影响 由图3可知，液体发酵过程中，不同的碳氮比对大白桩菇菌丝体的干质量及活性成分的含量均有明显的影响。在碳氮比为10∶1时，菌丝体干质量达到最大，随着碳氮比的增大，菌丝体干质量总体上呈下降的趋势，这可能是碳源含量过高，造成了富营养状态，抑制了菌丝体的生长。随着碳氮比的增加，多酚含量总体上呈现上升的趋势，在碳氮比为20∶1时，菌丝体多酚物质的积累达到最大，此时水提物中多酚含量为8.37 mg/g，醇提物中多酚含量为3.35 mg/g。随着碳氮比的增加，菌丝体黄酮物质的积累呈现先增加后减少的趋势。在碳氮比为20∶1时，菌丝体醇提物的黄酮含量达到最大，为3.56 mg/g；在碳氮比为30∶1时，菌丝体水提物的黄酮含量达到最大，为0.59 mg/g。在碳氮比为20∶1时，菌丝体的粗多糖含量达到最大，为226.49 mg/g，其次是碳氮比为30∶1时，粗多糖含量为218.61 mg/g。碳氮比对大白桩菇液体培养中菌丝体的积累及活性成分的含量影响不一，因此综合各指标可推断，碳氮比为10∶1时是菌丝体干质量积累的最佳碳氮比；碳氮比为20∶1是菌丝体活性物质积累的最佳碳氮比。

2.1.4 pH对大白桩菇菌丝体干质量及活性成分含量的影响 由图4可知，液体发酵过程中，不同的p H值对大白桩菇菌丝体的干质量及活性成分的含量均有明显的影响。在pH值为5时，菌丝体干质量达到最大（4.82 g/L），随着p H值的增大或减小，菌丝体干质量都呈下降趋势，因此，pH值为5时最有利于菌丝体干质量的积累。pH值为5时也有利于菌丝体多酚物质的积累，水提物中多酚含量为8.62 mg/g，醇提物中多酚含量为0.88 mg/g，其次是pH值为6。pH值为7时，发酵液中多酚含量最高，为1.16 mg/mL，其次是pH值为6。pH值为6时，有利于菌丝体黄酮物质、粗多糖的积累，醇提物中黄酮含量为5.29 mg/g，水提物中黄酮含量为0.56 mg/g，菌丝体的粗多糖含量为221.02 mg/g。pH对大白桩菇菌丝体干质量的积累及活性成分的含量影响不一，因此综合各指标可推断，p H值为5是菌丝体干质量、多酚物质积累的最佳pH值；pH值为6是菌丝体黄酮、粗多糖积累的最佳p H值。

2.2 响应面试验优化

在单因素试验的基础上，以菌丝体干质量（Y）作为响应值，对海藻糖（A）、牛肉浸膏（B）、pH（C）3个因素进行3因素3水平的Box-Behnken试验，试验设计及结果如表2所示。将各因素使用Designexpert 8.0软件对试验结果进行统计分析，由表3可知，模型P值<0.01，说明该模型有意义且达到了极显著水平；失拟项P=0.123 4（P>0.05），不显著，表明该方程合理可靠。一次项A、B对结果影响显著（P<0.05），C对结果影响不显著（P>0.05），交互项AB对结果影响显著（P<0.05），AC、BC对结果影响不显著（P>0.05），二次项A2、C2对结果影响极显著（P<0.01），B2对结果影响不显著（P>0.05），3个单因素对菌丝体干质量的影响顺序为B>A>C，即：牛肉浸膏>海藻糖>pH。经Designexpert 8.0软件拟合出回归方程为：Y=5.35－0.13A－0.16B+0.075C－0.21AB+0.06AC+0.15BC－0.55A2－0.12B2－0.35C2。

表2 响应面试验设计因素水平及结果Tab.2 Factor levels and r esults of response sur face test design

表3 二次回归方程方差分析Tab.3 Anova of quadratic regression equation

图5可直观反映影响菌丝体干质量的3个因素两两之间的交互作用，随着海藻糖、牛肉浸膏、pH的增加，菌丝体干质量均出现先升高后降低的趋势，且均出现极值。AB、BC相互作用的曲面比较大，AC相互作用的曲面比较小，说明海藻糖与牛肉浸膏、牛肉浸膏与pH的交互作用明显，海藻糖与pH的交互作用不明显。沿牛肉浸膏（B）方向比海藻糖（A）的响应面坡度更陡，说明牛肉浸膏对大白桩菇液体发酵培养的影响大于海藻糖，与方差分析结果一致；沿海藻糖（A）方向比pH（C）方向的响应面坡度更陡，说明海藻糖对大白桩菇液体发酵培养的影响大于pH，与方差分析结果一致。

由响应面法分析得出的最佳培养方案为：海藻糖25.08 g/L、牛肉浸膏6.33 g/L、p H值4.95、磷酸二氢钾0.5 g/L、硫酸镁0.25 g/L、维生素B110 mg/L，在此配方下进行5次验证试验，得出大白桩菇菌丝体干质量为5.26 g/L，与预测值接近，相对误差为2.77%，证明该培养方案是有效可行的。

3 结论与讨论

食用菌属于异养微生物，主要由培养基来提供生长所需的营养物质，如碳源、氮源、无机盐、生长因子等[16-17]，此外，液体发酵过程中培养基的p H、摇床转速、培养温度、接种量等都会影响食用菌菌丝体的生长与发育。碳源是食用菌最重要的营养源之一，为食用菌的生长发育提供能量[18]，大白桩菇液体发酵过程中均能利用供试的5种碳源，对菌丝体干质量的影响从大到小排序为：海藻糖>葡萄糖>蔗糖>麦芽糖>乳糖，这与张秋卉[6]的研究结果相一致。刘小霞等[19]研究表明，海藻糖对于草菇退化菌种有较好的复壮效果，有可能是由于大白桩菇菌种在继代培养过程中出现了菌种退化现象，因此，导致了海藻糖的作用效果较为突出。氮源是菌丝生长过程中必需的营养物质[20]，大白桩菇液体发酵过程中均能利用供试的5种氮源，其影响从大到小排序为：牛肉浸膏>硫酸铵>蛋白胨>酵母粉>麸皮（以菌丝体干质量为指标），这与王谦等[8]的研究结果不一致，一方面可能是由于试验所设的氮源较少，未涵盖所有的氮源，另一方面可能是采用的培养方式、培养基中的微量元素存在差异。液体发酵培养基可提供菌丝生长所需的各种营养物质，且适宜的营养比例可促进菌丝生长及次生代谢产物的积累[21]，大白桩菇在液体发酵过程中，碳氮比为10∶1时，菌球干质量、菌球密度均能达到最大。由于在液体发酵过程中会随着培养时间的增加，培养液的p H值发生一定的变化，试验中的pH值均为灭菌前所调试的初始pH值，在pH值为5时菌丝体干质量达到最大，之后随着p H的增加，菌丝体干质量呈下降趋势，因此，大白桩菇液体发酵的最适pH值为5。

食用菌在液体发酵过程中会产生多种化合物，主要来自于其胞内外浸出液和发酵过程中产生的次级代谢产物，某些活性物质的含量可能远远高出子实体中的含量[22]。多酚类是食用菌代谢产物中最重要的组分之一，具有显著的抗炎效果[23]；黄酮类物质具有抗氧化、抗癌、抗过敏、增强免疫功能等诸多功效[24-25]；多糖是食用菌生物活性最显著、含量最高的物质[22]，目前，食用菌多糖的开发与利用越来越受重视[26]，卫银等[27]研究表明，发酵液浓缩比例、乙醇浓度、醇沉时间、发酵液pH值都会影响蛹虫草胞外多糖的提取量。大白桩菇在液体发酵过程中，获得最高菌丝体干质量的培养基配方并不能积累到最大含量的活性物质，表明了同一个培养基配方不能同时兼顾发酵产物中高菌丝体干质量与高活性物质含量的获得，这与林群英等[28]的研究结果相一致。在所设置的试验方案中研究表明，葡萄糖、硫酸铵、p H值为5有利于菌丝体多酚物质的积累；蔗糖、蛋白胨、pH值为6有利于菌丝体黄酮、粗多糖的积累；碳氮比为20∶1均有利于菌丝体3种活性成分的积累。本试验结果可为大白桩菇液体发酵过程中活性物质的获得提供一定的参考依据。

在单因素试验的基础上，结合响应面分析法优化大白桩菇液体发酵工艺以获得其更高干质量的菌丝体，其最佳配方为：海藻糖25.08 g/L、牛肉浸膏6.33 g/L、pH值4.95、磷酸二氢钾0.5 g/L、硫酸镁0.25 g/L、维生素B110 mg/L。在试验中尚未对发酵周期进行研究，许多研究表明，不同发酵时长对菌丝体干质量及活性物质的积累存在着显著的影响，今后可在该方面进行深入研究，为大白桩菇的开发利用提供更详尽的参考依据。