基于食品废弃物为碳源的荧光碳量子点的制备及模拟酶催化性能的探究

关桦楠，王丹丹，刘树萍，刘晓飞

哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150028

荧光纳米材料包括荧光碳纳米材料[1]、荧光金属纳米材料[2]、多功能复合纳米材料[3]和金属框架[4]等，该材料尺寸较小，且具有特定的荧光特性[5]以及量子效应等性质。近年来由于其低成本、易制备等特点逐渐成为模拟酶的优选材料，为食品[6]、医疗[7]和生化[8]领域带来了崭新的发展机遇。

纳米模拟酶不仅克服了天然酶制备烦琐、苛刻条件下变性率高、纯化和保存过程成本高等众多缺陷，还具有低毒性、易制备、高稳定性以及良好的生物相容性等优势，因此成为近年来模拟酶领域中最具潜力的纳米材料。其中，荧光碳量子点(fluorescent carbon quantum dots，FCD)相对于半导体量子点的性质更加稳定[9],与有机染料相比具有良好的抗光漂白性[10],与贵金属纳米团簇相比具有低毒性[11]、良好生物相容性[12]、环境友好性[13]等优点而备受关注。荧光碳量子点作为新型纳米模拟酶，具有可靠的反应性、可调的催化活性和良好的稳定性，广泛应用于各个领域[14-17]。

绿色化学亦称环境无害化学或环境友好化学，一步水热法是一种绿色合成方法，也是目前制备碳量子点最常用的方法，使用化学试剂较少，原料成本低廉，还具有合成方法简单快速、对环境污染小的优势[18]。因此作者以玉米芯、葵花籽壳、葡萄籽食品废弃物为原料，采用一步水热法制备3种食品废弃物的荧光碳量子点，对其进行透射电镜(transmission electron microscope, TEM)、紫外-可见光谱(ultraviole-visible spectroscopy, UV-Vis)、傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectoscopy, FT-IR)、荧光光谱扫描表征、过氧化物酶活性的验证及酶促反应动力学的相关研究。由于所制备的荧光碳量子点作为模拟酶催化时会造成自身荧光的淬灭，因此可以广泛应用到各个分析领域中，同时也为荧光碳量子点的规模化制备提供可行的思路与技术参考。

1 材料与仪器

1.1 原料与试剂

甜玉米芯：哈尔滨香坊农场；生瓜子：安徽洽洽食品有限公司；巨峰葡萄：湖北省荆州市埠河镇；ABTS(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；过氧化氢(分析纯)、NaAc·3H2O(分析纯)、冰醋酸(分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FC 204型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；YZHR-25水热反应釜、鼓风干燥箱、电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；TD5A离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司；LVEM5透射电子显微镜：QUANTUM量子科学仪器贸易(北京)有限公司；H-113ATC分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；MAGNA-IR560E.S.P傅里叶变换红外光谱仪：美国Nicolet公司；F97 Pro荧光分光光度计：上海棱光技术有限公司。

2 试验方法

2.1 荧光碳量子点的制备

2.1.1 玉米芯荧光碳量子点(CFCD)

将蒸馏水清洗后的完整玉米芯分成4～5段，粉碎至60目，再将玉米芯粉末60 ℃干燥48 h，密封备用。在50 mL烧杯中依次加入0.6 g玉米芯粉末和30 mL去离子水，充分混匀后浸泡30 min。然后将整个浸泡体系倒入50 mL水热反应釜中，置于烘箱中200 ℃保持6 h，待反应结束后，将反应釜冷却至室温，所得黑褐色反应液3 000 r/min离心5 min，将离心后的反应液采用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，得到的溶液即为玉米芯荧光碳量子点混悬液。将所得混悬液于60 ℃干燥至粉末，采用去离子水清洗2～3次，再次干燥，保存于4 ℃环境中备用。

2.1.2 葡萄籽荧光碳量子点(GFCD)

用镊子剔出葡萄中的葡萄籽，将双蒸水清洗后的葡萄籽粉碎至60目，将葡萄籽粉末60 ℃干燥48 h，密封备用。在50 mL烧杯中依次加入1.2 g葡萄籽粉末和30 mL去离子水，充分混匀后浸泡30 min。然后将整个浸泡体系倒入50 mL水热反应釜中，置于烘箱中200 ℃保持6 h，待反应结束后，将反应釜冷却至室温，所得黑褐色反应液3 000 r/min离心5 min，将离心后的反应液采用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，得到的溶液即为葡萄籽荧光碳量子点混悬液。将所得混悬液于60 ℃干燥至粉末，采用去离子水清洗2～3次，再次干燥，保存于4 ℃环境中备用。

2.1.3 葵花籽壳荧光碳量子点(SFCD)

将葵花籽手动剥壳，用0.5%的NaOH溶液浸泡1.5 h，去除葵花籽壳中残余的脂类成分，将双蒸水清洗后的葵花籽壳用粉碎机进行粉碎至60目，将葵花籽壳粉末60 ℃干燥48 h，密封备用。在50 mL烧杯中依次加入1.2 g葵花籽壳粉末和30 mL去离子水，充分混匀后浸泡30 min。然后将整个浸泡体系倒入50 mL水热反应釜中，置于烘箱中200 ℃保持6 h，待反应结束后，将反应釜自然冷却至室温，所得黑褐色反应液3 000 r/min离心5 min，将离心后的反应液采用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，得到的溶液即为葵花籽壳荧光碳量子点混悬液。将所得混悬液于60 ℃干燥至粉末，采用去离子水清洗2～3次，再次干燥，保存于4 ℃环境中备用。

2.2 荧光碳量子点的表征

采用透射电子显微镜对所制备的3种荧光碳量子点进行观察。采用紫外分光光度计在275～450 nm分别对所制备的3种荧光碳量子点进行扫描。采用傅里叶红外光谱表征3种荧光碳量子点的表面基团情况，室温测试样品，通过10 MPa模压制成厚度30 μm左右薄膜，透射模式，波数4 000～400 cm-1，截取4 000～1 000 cm-1进行分析；采用荧光分光光度计扫描不同激发波长下3种荧光碳量子点的发射光谱，得到CFCD、GFCD、SFCD的最佳发射波长分别为475、550、477 nm，3种荧光碳量子点分别在最佳发射波长下扫描400～600 nm的荧光光谱。

2.3 荧光碳量子点催化性能的研究

2.3.1 荧光碳量子点模拟酶催化体系构建

以H2O2浓度、温度、时间为因素，考察其催化活性，分别将2 mg/mL玉米芯荧光碳量子点混悬液、4 mg/mL葡萄籽荧光碳量子点混悬液和4 mg/mL葵花籽壳荧光碳量子点混悬液各150 μL加入3 mL HAc-NaAc缓冲液(pH 4)中，依次再分别加入200 μL 25 mmol/L ABTS溶液和500 μL不同浓度(0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mmol/L)的H2O2，混合均匀后将体系分别置于不同温度(30、40、50、60、70 ℃)的水浴锅中，不同时间(20、30、40、50、60 min)后取出，吸取3 mL反应液，以蒸馏水的吸光度为空白，测定反应液在420 nm处的吸光度，平行试验3次。

2.3.2 荧光碳量子点模拟酶动力学

采用稳态动力学方法，通过在一定浓度范围内改变底物ABTS或H2O2的浓度，对荧光碳量子点的酶动力学进行评价，建立双倒数曲线图，并计算反应动力学参数。50 ℃进行反应，在3 mL HAc-NaAc缓冲液(pH 4)中添加150 μL荧光碳量子点混悬液(2 mg/mL玉米芯荧光碳量子点、4 mg/mL葡萄籽荧光碳量子点、4 mg/mL葵花籽壳荧光碳量子点)。以H2O2为底物，对ABTS的酶促反应动力学分析，在不同浓度ABTS的缓冲液中添加500 μL 50 mmol/L H2O2。以ABTS为底物，对H2O2的酶促反应动力学分析，在不同浓度的H2O2缓冲液中加入10 mmol/L ABTS。在420 nm处用紫外分光光度计对体系反应的最初5 min进行扫描，得到反应动力学参数。

V=Vmax×[S]/(Km+[S])，

式中：Km为米氏常数，mmol/L；V为反应初速度,mmol·L-1·s-1；[S]为底物浓度,mmol/L。

3 结果与讨论

3.1 表征

3.1.1 TEM表征

从图1a可知，玉米芯荧光碳量子点纳米粒子均具有突出的纳米结构，有显著的分散性，无明显聚集现象且显示为球形颗粒，粒径约为30 nm。从图1b可知，葡萄籽荧光碳量子点纳米粒子均具有突出的纳米结构，具有良好的分散性且显示为近球形颗粒，表面有很多小颗粒，粒径约为80 nm。从图1c可知，葵花籽壳荧光碳量子点纳米粒子均具有突出的纳米结构，虽部分聚集，但多数粒子分散性良好且显示为不规则形状颗粒，粒径大小约为50 nm。

图1 FCD的透射电子显微镜图Fig.1 TEM characterizations of FCD

3.1.2 UV-Vis分析

图2为3种荧光碳量子点的紫外可见吸收光谱，由图2可以看出，CFCD、GFCD、SFCD分别在324、320、326 nm处出现一个明显的紫外吸收峰，这是因为所制备的3种荧光碳量子点的表面态捕获激发态能量，并且通常这种碳量子点会表现出蓝色荧光。由此推测3种荧光碳量子点之所以能发出荧光可能是基于表面缺陷态发光[19]。

图2 FCD的紫外可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectra of FCD

3.1.3 FT-IR光谱分析

图3 FCD的红外光谱Fig.3 FT-IR spectra of FCD

3.1.4 荧光光谱分析

图4为CFCD、GFCD、SFCD的荧光光谱，由图4可以看出,2 mg/mL的CFCD、4 mg/mL的GFCD、4 mg/mL的SFCD分别在475、550、477 nm处出现一个明显的吸收峰，且玉米芯荧光碳量子点的峰值荧光强度明显高于葡萄籽荧光碳量子点和葵花籽壳荧光碳量子点的荧光强度，说明玉米芯荧光碳量子点的p-p共轭双键的分子结构与其他两种荧光碳量子点相比较多，由于p电子共轭程度越大，荧光强度越大，因此可以推测出玉米芯荧光碳量子点的p电子共轭程度比另外两种荧光碳量子点的要大。大多数含芳香环、杂环的化合物能发出荧光，从取代基对分子发射荧光的影响来说，部分含氧官能团被电子基团所取代，会使p共轭程度升高从而荧光强度增加，比如—CH3、—OH、—OR等，由此推断CFCD的含氧官能团数量较多[20]。

图4 FCD的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of FCD

3.2 荧光碳量子点模拟过氧化物酶活性

研究表明，过氧化物酶可以催化底物氧化的原因之一是H2O2为电子受体，引起体系颜色发生变化，模拟酶能够催化H2O2与底物ABTS反应产生绿色产物。为了证实荧光碳量子点具备模拟过氧化物酶的活性，而不是该原料本身参加ABTS氧化反应，本试验进行了不同成分因素在催化反应中的相关对比，试验结果如图5—图7所示。结果表明，荧光碳量子点-H2O2体系、荧光碳量子点-ABTS体系、H2O2-ABTS体系溶液体系均既没有出现特征吸收峰又没有颜色的变化，体现了反应体系中没有荧光碳量子点时，体系中各成分不发生任何氧化还原反应。只有荧光碳量子点、H2O2、ABTS同时存在时才会发生反应，反应体系溶液呈绿色(曲线d)，荧光碳量子点-H2O2-ABTS体系在波长420 nm处具有显著的紫外吸收峰，该峰是由于ABTS被荧光碳量子点氧化成ABTS·+所形成的。综上所述，只有在荧光碳量子点、H2O2和ABTS共同存在的条件下，荧光碳量子点可以作为过氧化物模拟酶，催化H2O2产生大量的活性物质，进一步促进ABTS发生颜色变化。因此，说明该荧光碳量子点可以模拟与HRP天然酶类似的过氧化物酶活性[21]。

图5 CFCD的模拟酶催化活性Fig.5 Peroxidase-like catalytic activity of CFCD

图6 GFCD的模拟酶催化活性Fig.6 Peroxidase-like catalytic activity of GFCD

图7 SFCD的模拟酶催化活性Fig.7 Peroxidase-like catalytic activity of SFCD

3.3 荧光碳量子点酶动力学的研究

3.3.1 玉米芯荧光碳量子点酶动力学

对CFCD模拟酶催化稳态动力学进行研究，结果如图8所示。由图8a、8b可知，当以固定浓度的ABTS为底物时，反应初速度随着H2O2浓度的增加而增加，然后逐渐平缓直至稳定；当以固定浓度的H2O2为底物时，反应初速度随着ABTS浓度的增加而增加，然后逐渐平缓直至稳定。结果表明，当ABTS的浓度在0.1～7.5 mmol/L范围内，ABTS的浓度与反应初速度符合典型的Michaelis-Menten方程[22]。以催化反应初速度倒数、底物浓度倒数为坐标作双倒数曲线图，可以直观显示出模拟酶稳态动力学的变化趋势，由图8c、8d所示，对双倒数曲线图进行线性拟合，呈现出良好的正相关线性关系。根据双倒数曲线的截距和斜率，可计算CFCD的催化动力学常数。

注：a. H2O2浓度对反应初速度的影响； b. ABTS浓度对反应初速度的影响； c. H2O2浓度倒数对反应初速度倒数的影响； d. ABTS浓度倒数对反应初速度倒数的影响。图9和图10同。

3.3.2 葡萄籽荧光碳量子点酶动力学

对GFCD模拟酶催化稳态动力学进行研究，结果如图9所示。由图9a、9b所示，当以固定浓度的H2O2为底物时，反应初速度随着ABTS浓度的增加而增加，然后逐渐平缓直至稳定；当以固定浓度的ABTS为底物时，反应初速度随着H2O2浓度的增加而增加，然后逐渐平缓直至稳定。结果表明，当ABTS的浓度在0.5～10 mmol/L范围内，ABTS的浓度与反应初速度符合典型的Michaelis-Menten方程[22]。以催化反应初速度倒数、底物浓度倒数为坐标作双倒数曲线图，可以直观显示出模拟酶稳态动力学的变化趋势，由图9c和d所示，对双倒数曲线图进行线性拟合，呈现出良好的正相关线性关系。根据双倒数曲线的截距和斜率，可计算GFCD的催化动力学常数。

图9 GFCD稳态反应动力学Fig.9 Steady state reaction kinetics of GFCD

3.3.3 葵花籽壳荧光碳量子点酶动力学

对SFCD模拟酶催化稳态动力学进行研究，结果如图10所示。由图10a、10b所示，当以固定浓度的ABTS为底物时，反应初速度随着H2O2浓度的增加而增加，然后逐渐平缓直至稳定；当以固定浓度的H2O2为底物时，反应初速度随着ABTS浓度的增加而增加，然后逐渐平缓直至稳定。结果表明，当ABTS的浓度在0.1～7.5 mmol/L范围内，ABTS的浓度与反应初速度符合典型的Michaelis-Menten方程[22]。以催化反应初速度倒数、底物浓度倒数为坐标作双倒数曲线图，可以直观显示出模拟酶稳态动力学的变化趋势，由图10c、10d所示，对双倒数曲线图进行线性拟合，呈现出良好的正相关线性关系。根据双倒数曲线的截距和斜率，可计算SFCD的催化动力学常数。

图10 SFCD稳态反应动力学Fig.10 Steady state reaction kinetics of SFCD

玉米芯荧光碳量子点、葡萄籽荧光碳量子点、葵花籽壳荧光碳量子点的动力学参数如表1所示。酶与底物结合能力可以利用米氏常数(Km)来判断，Km越大，亲和能力越弱，Km越小，亲和能力越强[23]。由表1可知，玉米芯荧光碳量子点对H2O2的Km为1.131 8 mmol/L，亲和力更好。荧光碳量子点对H2O2、ABTS的Km顺序:CFCD

表1 FCD的催化动力学参数Table 1 Catalytic kinetic parameter of FCD

4 结论

以3种食品废弃物为碳源，采用一步水热法成功制备3种具有微小粒径和较高催化活性的荧光碳量子点。采用一步水热法绿色制备荧光碳量子点不仅具有环境友好的特点，还具有广阔的应用领域和实践价值，近年来荧光碳量子点独特的荧光特性和过氧化物酶活性在物质检测中逐渐成为研究热点，部分荧光碳量子点在作为模拟酶催化物质的同时发生荧光强度的改变，从而达到物质检测的目的，所以荧光碳量子点在食品分析领域中有巨大的潜力。