Chaetomium globosum CGMCC 6882产黄酮类化合物的发酵工艺及产物抗氧化活性研究

付乾振，梁小娜，郑欣欣，盛丽丽，张 迪，潘亚萍，余晓雪，王子朝，张慧茹

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州450001

植物内生真菌是一类在一定时期或者全部时期生活在植物的器官和组织内部的真菌，普遍存在于高等植物中。从植物中分离得到的内生真菌其合成的物质与宿主植物可以具有相似或相同生物活性，并且内生真菌在合成和生产活性物质时还具有时间短、占地少、可控性强、环保清洁、效率高等优点[1-2]。近年来，内生真菌产黄酮的特性和黄酮的生物活性已引起人们的广泛关注。孙科等[3]利用卷枝毛霉SN2 017发酵生产银杏黄酮，并进行了发酵工艺的优化，黄酮的产量达到56.63 mg/mL。黄酮是一种存在于自然界的次级代谢多酚类化合物，不仅参与植物防御过程[4]，还可通过自由基裂解、金属离子螯合等方式，发挥抑菌、抗炎、抗氧化、调节免疫、保护心血管和调节肠道菌群等作用[5-9]。

绞股蓝是一种兼具药用和食用的藤蔓类植物，其活性成分包括黄酮、多糖、皂苷等[10]。但植物资源生长周期长、活性成分含量低、不可再生等缺点限制其药用和食用价值的发挥；与此同时，大规模地从植物中提取活性物质有可能引发的物种危机和破坏生态平衡等问题也限制了其开发和应用[11]。目前，从绞股蓝植物中提取黄酮的工艺优化研究较多[12]，尚未见绞股蓝内生真菌产黄酮发酵工艺研究方面的报道。因此，作者研究绞股蓝内生真菌ChaetomiumglobosumCGMCC 6882产黄酮类化合物的发酵工艺及其抗氧化活性，以期为微生物法发酵生产黄酮类化合物提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

绞股蓝内生真菌ChaetomiumglobosumCGMCC 6882，由河南工业大学生物工程学院动物生理实验室从绞股蓝植物中分离，经CGMCC鉴定为ChaetomiumglobosumCGMCC 6882。

1.2 主要试剂

芦丁标品：西安飞达生物技术公司；淀粉、酵母粉：北京奥博星生物技术有限公司；磷酸氢二钾、钼酸钠：天津市科密欧化学试剂开发中心；胎牛血清、DMEM高糖培养基：美国Hyclone公司；MTT、DMSO、S0109 SOD检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 仪器与设备

722 N分光光度计：上海精科实业有限公司；SPX-150BS-Ⅱ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；XFH-50CA电热式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；TGL-16gR高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SK-1漩涡振荡器：金坛市华峰仪器有限公司；Series 8000 WJ CO2细胞培养箱：美国Thermo Fisher公司。

1.4 方法

1.4.1 芦丁标准曲线及发酵液中黄酮含量测定

准确称取20 mg芦丁标品，加入100 mL容量瓶中，然后加入体积分数70%的乙醇溶液至100 mL，充分摇匀。分别移取芦丁乙醇标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL至25 mL容量瓶中。分别加入0.7 mL 5%的NaNO2溶液，振荡摇匀后静置5 min，再分别加入0.7 mL 10%的Al(NO3)3溶液，充分混匀后室温下再静置5 min，加入1 mol/L NaOH溶液10 mL，最后用体积分数70%的乙醇溶液定容至刻度，并根据溶液在510 nm处的吸光度绘制芦丁标准曲线。芦丁标品的吸光度与质量浓度存在良好的线性关系，Y=0.022X-0.003(R2=0.998 5)。分别在第0、1、3、5、7天取空白对照组和试验组发酵液各2 mL，离心(12 000 r/min，10 min)并收集上清液，测定510 nm处的吸光度并计算待测样品中黄酮含量。

1.4.2 培养基组成优化

参考张洋等[13]的方法并稍加修改。以淀粉40 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO41 g/L、NaCl 0.05 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl20.03 g/L、酵母粉1 g/L为基础培养基。以淀粉、葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖等分别作为碳源，接入菌种在恒温振荡培养箱中28 ℃、160 r/min培养7 d，然后采用芦丁检测法在510 nm处测定吸光度，计算黄酮产量。同样，以NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等分别作为氮源；钼酸钠、氯化镍、硫酸铜、硼酸、碘化钾等分别作为微量元素来源；KCl、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、NaNO3等分别作为无机盐，对培养基组成进行优化。

1.4.3 发酵条件优化

配制发酵培养基初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接入菌种，并于恒温振荡培养箱中28 ℃、160 r/min培养7 d，采用芦丁检测法在510 nm处测吸光度确定最佳pH值。同理，接种量分别设为3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%(V/V)；发酵时间分别设为3、5、7、9、11 d，以确定最佳接种量和发酵时间。然后分别以接种量、发酵时间、pH值为影响因素对C.globosumCGMCC 6882发酵产黄酮类化合物的培养条件进行响应面优化。

1.4.4 黄酮的提取

发酵结束后，将发酵液取出并用8层纱布过滤，然后将滤液在50 ℃、0.1 MPa条件下用旋转蒸发仪进行浓缩。之后按照滤液和无水乙醇体积比1∶ 3溶解黄酮，将获得的乙醇黄酮溶液进行抽滤、除杂、浓缩、真空冷冻干燥等处理，进而获得黄酮冻干粉末备用。

1.4.5 黄酮的体外抗氧化活性

参照文献[14]的方法检测C.globosumCGMCC 6882发酵所得黄酮类化合物对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的清除效果。

1.4.6 黄酮的细胞抗氧化活性

参照Wang等[15]的方法，采用H2O2构建Caco-2细胞氧化损伤模型，进行Caco-2胞内的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的检测。

1.5 数据统计与分析

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面优化试验设计和分析；采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析；采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 培养基组成优化

大量研究已经证实，微生物在生长繁殖及产物合成等过程中受培养基中碳源、氮源、无机盐、微量元素和生长因子等影响[16]。由图1a可知，C.globosumCGMCC 6882发酵产黄酮的培养基中其他组分不变时，加入不同碳源所得黄酮产量有较大差异，其中以淀粉为碳源时黄酮产量最高，达到1.09 mg/L，因此在后续培养基中最佳碳源选用淀粉。采用同样方法进行优化，得出培养基中最佳氮源种类为酵母粉(图1b)，最佳微量元素来源为钼酸钠(图1c)，最佳无机盐种类为磷酸氢二钾(图1d)，相应的黄酮最高产量分别为1.23 mg/L、1.35 mg/L和1.50 mg/L。

图1 C. globosum CGMCC 6882产黄酮的培养基组成优化Fig.1 Optimization of medium composition for flavonoids production by C.globosum CGMCC 6882

2.2 发酵条件优化

单因素试验结果如图2所示，随着发酵时间的延长，发酵的前7 d，黄酮产量急剧增加；发酵7 d后，黄酮产量趋于平稳(图2a)。随着接种量的增加，黄酮产量先增加后减少，最高黄酮产量对应的接种量为5%(图2b)。pH值对黄酮产量的影响与接种量的趋势一致，最高黄酮产量对应的pH值为6(图2c)。

图2 C.globosum CGMCC 6882产黄酮的单因素试验Fig.2 Single factor test of flavonoids production by C. globosum CGMCC 6882

以黄酮产量为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平的Box-Behnken试验。试验结果如表1所示，进行多元回归拟合，得到以黄酮产量(Y)为响应值的回归方程：Y=2.22+0.05A-0.028B+0.075C+0.028AB+2.5×10-3AC-0.028BC-0.22A2-0.12B2-0.17C2。对模型进行显著性检验，如表2所示，模型的P<0.000 1，表明模型极显著；失拟项P=0.341 4>0.05,表明模型拟合效果好，可用于研究C.globosumCGMCC 6882生产黄酮的发酵工艺优化。P越小，表明该因素对黄酮产量的影响越明显，3个因素对黄酮产量影响由大到小为pH值、发酵时间、接种量。

表1 C.globosum CGMCC 6882的响应面试验设计与结果Table 1 Response surface test design and results of flavonoid production by C. globosum CGMCC 6882

表2 Box-Behnken试验设计回归分析Table 2 Regression analysis of experimental results based on Box-Behnken design

响应面法优化的C.globosumCGMCC 6882发酵产黄酮的最佳条件：发酵时间7.22 d，接种量4.88%，pH 6.23，发酵液中黄酮含量预测最大值为2.24 mg/L。按此条件进行验证试验，C.globosumCGMCC 6882发酵产黄酮类物质产量最大达到2.23 mg/L，与预测值相差0.01 mg/L，结果可靠。

2.3 体外抗氧化活性

自由基可通过引起DNA、蛋白质等生物大分子氧化损伤而诱发心脑血管疾病和糖尿病等[17]。由图3可知，C.globosumCGMCC 6882发酵所得黄酮类物质可有效清除DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基，并且清除率与黄酮质量浓度呈正相关性。黄酮质量浓度为3.0 mg/mL时，对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为(75.2±1.4)%、(84.3±0.8)%、(82.8±1.9)%和(81.5±2.8)%。研究表明，黄酮类化合物通过直接清除自由基、抑制机体的氧化酶和螯合金属离子等方式发挥抗氧化活性[18]。在直接清除自由基的过程中，黄酮类化合物各个环上的羟基位点与自由基发生反应，生成水以达到清除自由基的目的[19]；也可以抑制脂氧合酶、黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶等氧化酶的活性，减少自由基的产生[20-22]；还可以螯合金属离子，避免过量的金属离子诱导氧化应激产生羟基自由基[23]。

图3 不同质量浓度黄酮对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effects of different concentrations of flavonoids on DPPH radical, hydroxyl radical, ABTS radical and superoxide anions radical

2.4 细胞抗氧化活性

当细胞活性下降至50%左右时，说明构建的细胞氧化损伤模型成功，而此时所对应的H2O2浓度为400 μmol/L，因此在后续细胞氧化损伤模型试验时采用400 μmol/L的H2O2。黄酮的细胞抗氧化损伤模型试验结果见图4，H2O2组的MDA含量显著升高，SOD、CAT和GSH-Px活力均显著下降，说明H2O2对Caco-2细胞造成了氧化损伤。C.globosumCGMCC 6882发酵所得黄酮组的SOD(图4a)、CAT(图4b)和GSH-Px(图4c)酶活水平明显升高，1.0 mg/mL黄酮使SOD、CAT和GSH-Px酶活水平分别从(156.2±4.3)、(15.1±0.9)、(22.8±5.8) U/mg增加至(258.3±5.8)、(44.3±0.7)、(51.5±0.5) U/mg。与H2O2试验组相比，添加C.globosumCGMCC 6882发酵所得黄酮进行抗氧化保护时，可以有效降低MDA含量，1.0 mg/mL黄酮使MDA含量从(16.8±0.2) μmol/g降至(6.3±0.3) μmol/g(图4d)。上述结果表明，C.globosumCGMCC 6882发酵所得黄酮对被H2O2氧化损伤的Caco-2细胞有很好的保护作用。这与段宙位等[24]研究沉香叶黄酮保护H2O2诱导HepG2细胞氧化损伤时，MDA、SOD、CAT和GSH-Px指标变化趋势具有一致性，但是各指标酶活水平存在差异。这可能与黄酮类化合物的来源、种类和结构有关。黄酮类化合物通过降低MDA含量，减少细胞膜的氧化损伤程度；还可能通过提高细胞内SOD、CAT和GSH-Px酶活水平，提高机体的抗氧化性，进而清除机体过多的自由基，保护细胞的氧化损伤。

图4 不同质量浓度黄酮对Caco-2胞内SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影响Fig.4 Effects of different concentrations of flavonoids on the activities of SOD,CAT, and GSH-Px and the content of MDA in Caco-2 cells

3 结论

研究结果表明：C.globosumCGMCC 6882发酵产黄酮类化合物的最佳培养基组成为淀粉、酵母粉、钼酸钠和磷酸氢二钾；最佳发酵条件为发酵时间7.22 d、接种量4.88%(V/V)和pH 6.23。在此条件下，黄酮类化合物的产量进一步提高，可用于C.globosumCGMCC 6882发酵生产黄酮的工业化提取。C.globosumCGMCC 6882发酵所得黄酮类化合物具有良好的体外抗氧化活性，且通过降低MDA含量和增强机体抗氧化酶活性来保护细胞氧化损伤。本研究为黄酮类化合物的制备和抗氧化活性的应用提供基础数据。