核磁共振技术在首批中药化学对照品研制中的应用△

刘静，冯玉飞，刘阳，戴忠，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术是一种非常重要的有机化合物结构解析工具[1-3]。通过解析一维谱（如1H-、13C-NMR）化学位移值、谱峰多重性、偶合常数值、谱峰相对强度和各种二维谱[如异核单量子相关谱（HSQC）、异核多键相关谱（HMBC）、1H-1H COSY]中呈现的相关峰，能够获取定性结构信息。对于结构复杂或结构未知的化合物，通常需要结合其他谱学方法确定其结构。对于结构简单或已知化合物，可直接通过一维谱信号或与文献值比对进行确定。NMR 还可以用于定量分析，以氢核磁共振定量（1H-quantitative nuclear magnetic resonance，1H-qNMR）应用最多，其原理是在合适实验条件下，信号峰面积与产生信号的质子数成正比[4-6]。1H-qNMR 具有样品用量少、测定时间短及无损等优势，目前已广泛应用于药品质量控制等领域，并已收载于《中华人民共和国药典》2020 年版[7]、《美国药典》USP40-NF35[8]和《欧洲药典》10.0版[9]等。

中药化学对照品主要从天然产物中提取精制而得，通常为结构已知成分，但由于天然产物结构复杂多样，常存在异构体，因此，首批对照品的定性鉴别工作仍需高度重视，准确鉴定其结构是对照品准确性的源头保障。在实际工作中，通常采用NMR、质谱、紫外、红外等谱学技术，但NMR 提供的结构信息更为丰富。中药化学对照品的定值目前采用国际通用的质量平衡法，对于首批品种而言，还需要其他定值方法进行佐证，尤以1H-qNMR 应用广泛。本文结合中药化学对照品首批研制实例，阐述了NMR的定性和定量特性，为充分保障首批对照品结构与定值的准确性提供了科学依据。

1 定性鉴定

1.1 结构相近化合物

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（1）和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（2）均属于黄酮苷类化合物，结构相近，两者结构差异在于黄酮苷元B 环（图1）。1H-NMR分析表明，前者B 环为C-3′，4′-二羟基取代，其B环质子H-5′作为1 个二重峰（d,J=8.0 Hz）出现在δ6.70～7.10 处，H-2′（d,J=2.0 Hz）和H-6′（dd,J=8.0,2.0 Hz）信号出现在δ7.20～7.50 处，且通过H-2′和H-6′化学位移可区别黄酮C-3′,4′位上是羟基还是甲氧基；后者B 环为C-4′位羟基取代，其B 环质子分为H-2′,6′和H-3′,5′，构成AA′BB′系统，且H-3′,5′化学位移比H-2′,6′化学位移值小，主要是C-4′位羟基的屏蔽作用及C 环对H-2′,6′的负屏蔽效应。通过13C-NMR 分析，C-2～4 位化学位移表明两者均属于黄酮-3-氧苷类化合物，进一步分析表明其A环为C-5，7-二羟基黄酮类化合物，其C-6和C-8 化学位移信号为δ90.0～100.0，且C-6 信号较C-8 信号处于较低场。此外，对于两者取代糖基的确定，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷质谱中出现m/z303 [M+H-162-146]+基峰碎片，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷质谱中出现m/z287[M+H-162-146]+基峰碎片，表明两者结构中均存在1 个六碳醛糖和甲基五碳醛糖；结合1H-NMR，通过2个糖端基质子信号偶合常数可判断分别为β-D型（J=7.5 Hz）和α-L型（J=1.0 Hz）；进一步综合1H-NMR、13C-NMR 信号确定为β-D-葡萄糖基和α-L-鼠李糖基。通过与文献比对，归属两者核磁信号[10]。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷：1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.30(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.26(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′),6.87 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.15 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.59 (1H,d,J=1.0 Hz,H-1″),4.31 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1‴),4.21 (1H,dd,J=3.5,1.5 Hz,H-2″),3.80 (1H,dd,J=11.0,3.5 Hz,H-3″),3.61 (1H,dd,J=12.0,4.5 Hz,H-6‴),3.57 (1H,dd,J=12.5,2.5 Hz,H-6‴),0.92 (3H,d,J=6.0 Hz,H-6″)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:159.3 (C-2),136.5 (C-3),179.6 (C-4),163.2 (C-5),99.9 (C-6),166.0 (C-7),94.7 (C-8),158.5 (C-9),105.9 (C-10),122.8 (C-1′),116.9 (C-2′),146.5 (C-3′),149.9 (C-4′),116.4 (C-5′),122.8(C-6′)；鼠李糖基:102.6 (C-1″),82.9 (C-2″),71.7(C-3″),73.5 (C-4″),72.0 (C-5″),17.7 (C-6″)；葡萄糖基：107.2 (C-1‴),75.3 (C-2‴),77.8 (C-3‴),70.7(C-4‴),77.8(C-5‴),62.1(C-6‴)。山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷：1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.72 (2H,dd,J=7.0,2.0 Hz,H-2′,6′),6.89(2H,dd,J=7.0,2.0 Hz,H-3′,5′),6.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.15 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6),5.67 (1H,d,J=1.0 Hz,H-1″),4.36 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1‴),4.23(1H,dd,J=3.5,1.5 Hz,H-2″),3.74 (1H,dd,J=10.0,3.5 Hz,H-3″),3.66 (1H,dd,J=12.0,2.5 Hz,H-6‴),3.61 (1H,dd,J=12.0,4.5 Hz,H-6‴),0.88(3H,d,J=7.5 Hz,H-6″)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:159.4 (C-2),136.4 (C-3),179.5 (C-4),163.2 (C-5),100.0 (C-6),166.1 (C-7),94.8 (C-8),158.6 (C-9),105.9 (C-10),122.5 (C-1′),132.0 (C-2′),116.6 (C-3′),161.7 (C-4′),116.6 (C-5′),132.0(C-6′)；鼠李糖基：102.5 (C-1″),82.7 (C-2″),71.7(C-3″),73.4 (C-4″),72.0 (C-5″),17.6 (C-6″)；葡萄糖基：107.1 (C-1‴),75.3 (C-2‴),77.8 (C-3‴),70.9(C-4‴),77.9(C-5‴),62.3(C-6‴)。

图1 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（1）和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（2）的化学结构式

1.2 同分异构体

地黄苷D（3）为环烯醚萜苷类成分，与文献报道的苦郎树苷C（sammangaoside C，4）[11]为同分异构体（图2），两者主要结构差异在于C-5位糖基连接位置不同。结合文献报道[11-13]，通过1H-NMR、13C-NMR 数据分析初步推断为地黄苷D；进一步通过HSQC、HMBC 等二维谱图分析，特别是HMBC 谱中葡萄糖端基质子δ4.92 (H-1″)与苷元C-5 位信号δ84.0 相关，葡萄糖端基质子信号δ4.82 (H-1‴)与碳信号δ82.8(C-2″)相关，以及葡萄糖基质子信号δ3.64(H-2″)与葡萄糖端基碳信号δ105.8(C-1‴)相关，由此确定环烯醚萜苷元C-5 位2 个葡萄糖基为1→2连接，即证明本品为地黄苷D，而非苦郎树苷C，同时明确地黄苷D信号归属：1H-NMR(600 MHz,D2O)δ:5.41

图2 地黄苷D（3）和苦郎树苷C（4）的化学结构式

(1H,d,J=5.4 Hz,H-1),6.55 (1H,d,J=6.6 Hz,H-3),5.28 (1H,d,J=6.6 Hz,H-4),4.52 (1H,s,H-6),5.87(1H,dd,J=1.8,1.2 Hz,H-7),3.31(1H,m,H-9),4.30(1H,d,J=15.6 Hz,H-10),4.24 (1H,d,J=15.6 Hz,H-10),4.78 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),4.92 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),4.82(1H,d,J=7.8 Hz,H-1‴)；13C-NMR(150 MHz,D2O)δ:98.6 (C-1),146.6 (C-3),107.0 (C-4),84.0 (C-5),83.0 (C-6),130.5 (C-7),147.4 (C-8),54.1 (C-9),62.5 (C-10),101.0 (C-1′),75.7 (C-2′),78.3 (C-3′),72.3 (C-4′),79.0 (C-5′),63.4 (C-6′),99.2 (C-1″),82.8 (C-2″),78.4 (C-3″),72.2 (C-4″),78.8 (C-5″),63.3 (C-6″),105.8 (C-1‴),76.8 (C-2‴),78.5(C-3‴),72.5(C-4‴),79.2(C-5‴),63.7(C-6‴)。

1.3 立体异构体

甲基莲心碱（5）为双苄基异喹啉类生物碱成分，与蝙蝠葛碱（6）为立体异构体（图3），两者主要结构差异在于C-1′位立体构型不同。在结构鉴定过程中，通过解析1H-NMR、13C-NMR谱图，并与文献比对[14]，初步鉴定为甲基莲心碱。对于其结构中2 个手性中心立体结构的确定方法，经文献调研可知，甲基莲心碱及其立体异构体蝙蝠葛碱中C-1和C-1′位的立体构型，可根据C-9、C-9′及C-4、C-4′的化学位移差值来确定[15-16]。通过本品核磁碳谱数据解析结果可知，C-9、C-9′及C-4、C-4′的化学位移差值分别为Δδ0.8、Δδ0.9，符合文献报道Δδ(C-9/C-9′)0.7，Δδ(C-4/C-4′)0.9，因此确定本品C-1 和C-1′位立体构型分别为R、S型，即为甲基莲心碱，信号归属为：1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ:3.59 (1H,dd,J=6.6,6.0 Hz,H-1),2.73,3.13 (各1H,m,H-3),2.53,2.82 (各1H,m,H-4),6.50 (1H,s,H-5),6.62 (1H,s,H-8),2.67(1H,m,H-9),3.04(1H,dd,J=5.4,13.8 Hz,H-9),6.90 (2H,d,J=8.4 Hz,H-11,15),6.69 (2H,d,J=8.4 Hz,H-12,14),2.49 (3H,s,C2-NCH3),3.72(3H,s,C6-OCH3),3.54 (3H,s,C13-OCH3),3.63 (1H,dd,J=6.0,6.0 Hz,H-1′),2.73,3.13 (各1H,m,H-3′),2.60,2.82 (各1H,m,H-4′),6.01 (1H,s,H-5′),6.38 (1H,s,H-8′),2.78 (1H,m,H-9′),2.99 (1H,dd,J=5.4,13.8 Hz,H-9′),6.55 (1H,d,J=1.8 Hz,H-11′),6.84 (1H,d,J=8.4 Hz,H-14′),6.69 (1H,重叠,H-15′),2.45 (3H,s,C2′-NCH3),3.79 (3H,s,C6′-OCH3),3.80 (3H,s,C7′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ:64.4 (C-1),46.7 (C-3),25.2 (C-4),129.2(C-4a),111.1 (C-5),147.1 (C-6),148.9 (C-7),112.3(C-8),131.1 (C-8a),40.6 (C-9),131.9 (C-10),130.4(C-11),113.4 (C-12),144.7 (C-13),113.4 (C-14),130.4 (C-15),42.7 (C2-NCH3),55.4 (C6-OCH3),55.1(C13-OCH3),64.7 (C-1′),47.2 (C-3′),26.1 (C-4′),125.7 (C-4a′),110.9 (C-5′),145.4 (C-6′),146.3 (C-7′),119.2 (C-8′),130.5 (C-8a′),39.8 (C-9′),131.4(C-10′),120.0(C-11′),142.8(C-12′),157.7(C-13′),115.4 (C-14′),125.2 (C-15′),42.5 (C2′-NCH3′),55.8(C6′-OCH3′),55.7(C7′-OCH3′)。

图3 甲基莲心碱（5）和蝙蝠葛碱（6）的化学结构式

25S-鲁斯可皂苷元（7）及其立体异构体25R-鲁斯可皂苷元（8）均属螺甾烷衍生物，分属螺甾烷醇和异螺甾烷醇类成分，其差别在于两者C-25位构型不同，分别为S构型和R构型（图4）。文献报道两者可通过13C-NMR谱中C-23～27位化学位移值可加以区分，其中25S-鲁斯可皂苷元相应化学位移值分别为δ26.5(C-23)、26.3 (C-24)、27.6 (C-25)、65.2 (C-26)、16.4(C-27)；25R-鲁斯可皂苷元相应化学位移值分别为δ32.1(C-23)、29.5(C-24)、30.7(C-25)、67.1(C-26)、17.4(C-27)[17-18]，在实际工作中，可参照此规律用于确定鲁斯可皂苷元C-25位立体构型。

图4 25S-鲁斯可皂苷元（7）和25R-鲁斯可皂苷元（8）化学结构式

2 定量分析

1H-qNMR 应用于首批中药化学对照品辅助定值时常采用内标法，按照公式（1）计算化合物含量。

其中，A样为样品选定信号的积分面积；A内为内标选定信号的积分面积；n样为样品被积分信号包含的质子数；n内为内标被积分信号包含的质子数；W样为样品称样量；W内为内标称样量；M样为样品相对分子质量；M内为内标相对分子质量[19]。

2.1 含残留溶剂对照品

1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯质量平衡法定值结果为95.61%。为更好地佐证定值结果的准确性，平行制备3 份样品进行1H-qNMR分析，以马来酸作为内标，氘代甲醇为溶剂，以样品中δ7.07 处氢信号为定量峰，δ6.32 氢信号为内标峰（图5），根据公式（1）计算结果为97.32%，RSD 为0.41%，与质量平衡法结果基本一致。需要特别指出的是，本品IH-NMR、I3C-NMR 谱图定性分析结果表明存在乙酸乙酯的相关信号，后经气相色谱法（GC）验证，外标法确定本品残留溶剂为乙酸乙酯，外标法计算其质量分数为1.73%，RSD 为1.28%；在1H-qNMR 分析时，以乙酸乙酯δ4.10 氢信号作为定量峰，计算其质量分数为1.67%，RSD为3.41%，与GC 测定结果基本一致。由此可见，1H-qNMR 可同时一步测定供试品及其所含残留溶剂含量，结果可靠，操作简便快速。

图5 1，4-二[4（-葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯的1H-qNMR谱图

2.2 其他对照品

地黄苷D 质量平衡法定值结果为95.55%。在进行1H-qNMR 分析时，以邻苯二甲酸氢钾作为内标，氘代水为溶剂，以样品中δ5.87 处氢信号为定量峰，邻苯二甲酸氢钾δ7.73 氢信号为内标峰，根据公式（1）计算结果为94.21%，RSD 为0.80%，与质量平衡法结果基本一致。

甲基莲心碱质量平衡法定值结果为99.09%。在进行1H-qNMR 分析时，以对苯二甲酸二甲酯作为内标，氘代三氯甲烷为溶剂，以样品中δ6.39 处氢信号为定量峰。对苯二甲酸二甲酯δ8.10 氢信号为内标峰，根据公式（1）计算结果为99.53%，RSD 为0.58%，与质量平衡法结果基本一致。

需要说明的是，尽管氢核磁共振定量法较质量平衡法操作简便，但测定结果的准确性也受一些因素影响，包括溶剂选择、内标物选择、溶解度及仪器相关参数设置等，在实际操作过程中应结合具体品种加以摸索优化[19]。

3 结论

中药化学对照品的重要性不言而喻，准确鉴定结构及确定其含量是保障发放品种准确的重要源头环节。中药化学对照品尽管是已知化合物，但由于其结构类型复杂多样，常存在结构相近、同分异构体及立体异构体等情况，NMR 可以提供化学位移值、偶合常数、谱峰多重性等丰富信息，能够揭示化合物的结构片段信息甚或立体结构，在中药化学对照品结构鉴定工作中具有不可替代的作用。此外，1H-qNMR 需要样品量少、无损、快速，可一步测定供试品含量及残留溶剂等有关物质，是目前常用的中药化学对照品首批品种定值佐证方法。