先天性心脏病患儿血清微小RNA-148b-3p表达水平及临床意义

潘 婉，李 伟，徐永君，孙 婧，张勇刚，郑永强

(1.宜昌市第二人民医院 三峡大学第二人民医院儿科，湖北 宜昌 443000；2.宜昌市第二人民医院 三峡大学第二人民医院心血管内科，湖北 宜昌 443000；3.汉川市人民医院儿科，湖北 汉川 431699；4.宜昌市第二人民医院 三峡大学第二人民医院神经内科，湖北 宜昌 443000)

先天性心脏病多发于不满1周岁的儿童群体，是新生儿疾病中常见的一种新血管疾病，是由于胎儿期心血管发育异常所造成的畸形病变。这种病有病程较长、致死率较高、预后较差等特征。据调查，全球每出生100名新生儿，就有8名患有先天性心脏病。先天性心脏病患儿由于异常的血流动力学，所以存在生长发育迟缓、免疫力低下、容易感染等问题[1-2]。先天性心脏病是多种病因综合作用的结果，该疾病谱系较广，具有单纯房间隔缺损、单纯室间隔缺损、心内膜垫缺损、法洛四联症等多种分型，一些患儿会同时合并多种畸形，病情较轻者可以终生无症状出现，但严重者可致死亡[3-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是由25个核苷酸组成的一类短链RNA。miR-148b-3p作为miRNA的一种，已经被报道与多种癌症的发生具有密切关系，如胃癌、乳腺癌、肺腺癌、肾癌等[5-7]。miR-148b-3p在之前的研究中也被作为缺血性脑卒中的生物学标志物[8-9]，但是miR-148b-3p在先天性心脏病患儿中的作用尚未见报道。因此，本研究探究先天性心脏病患儿血清miR-148b-3p的表达水平以及其与心功能指标之间的关系，分析其临床意义，希望为先天性心脏病的治疗及诊断提供一定的参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019年1月至2020年10月本院门诊及心内科病房收治的先天性心脏病患儿150例为研究对象(试验组)，其中男性80例，女性70例；年龄4个月至3岁。根据患儿情况又分为单纯房间隔缺损组(48例)、单纯室间隔缺损组(37例)以及复合组(65例)。病例纳入标准：患儿经临床诊断、心电图检查等确诊为先天性心脏病；具有完整临床资料；患儿全程的疾病治疗均在本院进行。排除标准：合并肝、肾功能损伤；患有中枢神经系统疾病；患有严重的肝脏疾病、消化系统疾病；患有电解质紊乱。选取同期在本院进行健康体检的儿童150例为对照组，其中男性74例，女性76例；年龄4个月至3岁。本研究已通过本院伦理委员会批准，获得患儿家属同意并签字，同时符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(批号：DP315；北京天根生化有限公司)；人肌钙蛋白I(cTnI)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(批号：20180602；郑州博赛生物技术研究所)；反转录试剂盒(批号：20180821；南京Vazyme生物公司)；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(批号：20181108；德国QIAGEN公司)；引物(批号：20180724；上海生工生物工程公司)。超声心电图仪购自美国惠普公司；MODEL550型酶标仪、qRT-PCR仪购自Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集与保存：分别采集两组儿童空腹静脉血血清样本(8 ml/人)，离心后小心收集血清样本，将其置于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.3.2 血清miR-148b-3p表达水平检测：采用qRT-PCR检测两组儿童血清miR-148b-3p表达水平。采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，反转录得到cDNA。采用qRT-PCR仪对miR-148b-3p进行扩增。反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共进行40个循环。采用2-△△CT法对miR-148b-3p表达水平进行相对定量分析。miR-148b-3p、U6(内参)引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.3.3 血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、cTnI水平检测：采用全自动生化分析仪检测两组儿童血清中CK-MB水平。采用ELISA法检测两组儿童血清中cTnI水平，操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.4 心功能指标检测：对两组儿童进行超声心动图检查，评估心肌收缩能力，记录左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期容积指数(LVEDVI)以及左心室收缩末期室壁应力(LVESWS)。

2 结 果

2.1 两组儿童一般资料比较 见表2。两组儿童体重指数、年龄、性别、身高比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 两组儿童一般资料比较

2.2 两组儿童血清miR-148b-3p及心功能指标水平比较 见表3。与对照组相比，试验组患儿miR-148b-3p、cTnI、CK-MB、LVEDVI、LVESWS水平显著升高，LVEF显著降低(均P<0.05)。

表3 两组儿童血清miR-148b-3p及心功能指标水平比较

2.3 三组患儿血清miR-148b-3p表达水平比较 见表4。单纯房间隔缺损组、单纯室间隔缺损组、复合组患儿血清miR-148b-3p水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。单纯房间隔缺损组和单纯室间隔缺损组患儿血清miR-148b-3p水平显著高于复合组(均P<0.05)，但单纯房间隔缺损组患儿血清miR-148b-3p水平与单纯室间隔缺损组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 三组患儿血清miR-148b-3p表达水平比较

2.4 先天性心脏病患儿血清miR-148b-3p水平与心功能指标相关性分析 见表5。Pearson相关性分析显示，先天性心脏病患儿血清miR-148b-3p水平与cTnI、CK-MB及LVEDVI、LVESWS呈正相关(P<0.05)，与LVEF呈负相关(均P<0.05)。

表5 先天性心脏病患儿血清miR-148b-3p水平与心功能指标的相关性

2.5 血清miR-148b-3p水平对先天性心脏病患儿的预测价值 ROC曲线分析显示，miR-148b-3p水平预测先天性心脏病患儿的曲线下面积为0.873，截断值为1.28，敏感度为81.33%，特异度为85.67%。

3 讨 论

先天性心脏病与环境、遗传等因素密切相关，属于非传染性疾病，是在人出生时便存在的心脏、血管功能以及结构发生异常的心脏类疾病，在儿科中较为常见，大约有60%的患儿不到1岁便死亡，是导致新生儿死亡的主要疾病之一[10-12]。先天性心脏病的发病原因主要是胚胎早期发育停滞现象或者胚胎发育异常，在临床表现上较为复杂化和多样化，较多为发育不良、感冒、反复呼吸道感染等症状[13]。近些年来，先天性心脏病患儿的发病率在全球呈现着逐年升高趋势，给患儿的整个家庭带来了沉重的负担，严重影响着患儿的正常生长。越来越多的研究发现，某些生物标志物能够很准确地反映疾病的发展状况，并可用于疾病的早期诊断及预后评估。沈海霞[14]的实验结果指出，miR-133a在先天性心脏病患儿血清中呈现高表达，与先天性心脏病的进程存在密切相关。

miRNA属于内源性非编码小RNA分子，广泛存在于真核生物体内，在机体发育、细胞分化以及疾病的发生与发展过程中都发挥着重要作用，可以通过靶向调控下游基因的表达来影响细胞生长、增殖、凋亡等生物学行为。近年来越来越多的研究发现miRNA参与调节多种细胞，并涉及多种疾病以及相关生物学行为。有研究[15-17]发现，miR-148b-3p与多种疾病的发生、发展密切相关，包括肿瘤增殖生长。有研究[18]发现，miR-148b-3p在胶质肿瘤细胞的侵袭和迁移能力方面具有非常重要的调控作用。王嘉明等[19]研究证明，miR-148b-3p可以影响心肌细胞的增殖和凋亡，将来可能成为治疗及诊断心血管疾病的靶点。龚化等[20]通过研究发现，miR-148b-3p在前列腺癌患者中表达水平降低，并且参与调控前列腺疾病中癌细胞的增殖与迁移过程。本研究结果发现，与对照组相比，试验组患儿cTnI、CK-MB、LVEDVI、LVESWS、miR-148b-3p水平显著升高，LVEF显著降低，提示先天性心脏病患儿存在心功能异常，且miR-148b-3p可能通过调控相关靶基因表达影响心肌细胞的增殖和凋亡等生物学行为，进而参与先天性心脏病发生。同时，本研究还发现，先天性心脏病患儿血清miR-148b-3p水平与cTnI、CK-MB及LVEDVI、LVESWS呈正相关，与LVEF呈负相关，表明miR-148b-3p可能通过某些机制直接或间接影响着心功能指标的变化，从而对疾病的发生、发展产生影响。进一步将先天性心脏病患儿分为单纯房间隔缺损组、单纯室间隔缺损组、复合组三组，发现单纯房间隔缺损组、单纯室间隔缺损组患儿血清miR-148b-3p水平显著高于复合组，说明miR-148b-3p水平与先天性心脏病的患病程度具有相关性，可能影响疾病发展进程，但具体机制还需进一步探讨。此外，ROC曲线分析显示，miR-148b-3p水平预测先天性心脏病患儿的曲线下面积、敏感度、特异度分均较高，说明miR-148b-3p可以用来预测先天性心脏病患儿。

综上所述，先天性心脏病患儿血清miR-148b-3p表达水平较高，且与先天性心脏病患儿心功能指标具有相关性，可以作为预测先天性心脏病患儿及评估其病情的参考指标。