早期母爱剥夺影响边缘系统-丘脑-皮质环路致大鼠成年后抑郁的机制研究

潘楠楠 卢浩扬 周列民 宁玉萍 方子妍▲

1.广州医科大学附属脑科医院神经科脑电图室，广东广州 510370；2.广州医科大学附属脑科医院药学部，广东广州 510370；3.中山大学附属第一医院神经科，广东广州 510080；4.广州医科大学附属脑科医院研究所，广东广州 510370

抑郁症是常见的精神心理疾病，据WHO 报道全球约有3.5 亿抑郁症患者[1]。抑郁症机制的研究是目前精神心理疾病研究的重点问题。出生后3～4年内（对大鼠相当于出生后1～14 d） 是神经系统发育的关键时期，研究证实在这个时期经历持续应激，对其成年以后的行为及心理发育造成不利的影响[2]，精神心理疾病的易感性显著增加[3]。研究发现早年应激（early life stress, ELS）可以增加成年后抑郁症的患病风险[4]。本课题组前期研究发现大鼠出生后早期母爱剥夺可致成年后的抑郁样行为，而这种行为的产生与母爱剥夺引起海马各区神经元数目减少有关[5]。目前关于ELS致成年后抑郁症易感性增加的机制尚不完全清楚，有研究者提出可能与ELS 造成大脑情感调节环路相关区域神经系统可塑性改变有关[6]。

边缘系统-丘脑-皮质环路（limbic-thalamic-cortical, LTC）对情感调节和传导具有重要作用，与情绪加工、记忆和控制网络密切相关[7]。研究证据证实抑郁症患者脑部的器质性病变主要定位于LTC 中[8]。本研究选用出生后早期母爱剥夺致抑郁大鼠模型为研究对象，采用盲法观察早期母爱剥夺对成年大鼠前额叶、海马区及丘脑神经元数目及星形胶质细胞表达的影响，验证ELS 致大鼠成年后抑郁样障碍中LTC 参与致病的现象，可望为临床寻找抑郁致病机制提出病理生理方面的基础证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 SPF 级SD 孕鼠购于广东省动物中心[许可证号：SCXK（粤）2008-0002]。大鼠按照随机数字表法分为母爱剥夺组（n=20）和对照组（n=20）。本实验开始前获得广州医科大学实验动物伦理委员会批准。在整个实验过程中采用盲法进行实验操作：课题设计者对实验动物及标本进行编号，并在整个实验过程中保密，实验操作者进行操作时随机选取动物及标本。

1.1.2 仪器与试剂 恒冷箱冷冻切片机（Leica 公司，CM1800型）；光学显微镜（Olypus 公司，BX62）；兔抗大鼠Neun多克隆抗体（abcam 公司，ab177487）、小鼠抗大鼠GFAP单克隆抗体(abcam 公司，ab4648)、山羊抗小鼠IgG H&L(abcam 公司，ab150115)、 驴抗兔IgG H&L (abcam 公司，ab150073)。

1.2 实验方法

1.2.1 母爱剥夺应激 母爱剥夺组大鼠从出生后第1天上午9:00～12:00 开始接受母爱剥夺：将母鼠从幼鼠笼移出，幼鼠笼放进30～34℃的恒温箱内，分离结束后再将母鼠放回原来的幼鼠笼内，每日1 次，持续14 d。对照组大鼠不予以任何处理。

1.2.2 动物行为评估 两组大鼠在饲养至2 个月龄时进行动物行为评估。评估内容具体如下。①糖水偏爱实验。大鼠单笼饲养，给予相同的两瓶清水，2 d 后，将清水替换为1%蔗糖水，2 d 后大鼠禁水16 h，后给予事先称好重量的清水和1%蔗糖水各一瓶，分别放在之前相同位置，2 h 后将两水瓶调换位置，4 h 后，取下瓶子称重。计算各大鼠的蔗糖水饮用量及蔗糖偏爱率（蔗糖水饮用量/总饮水量×100%）。②社交实验：将大鼠单独放入有一只同性陌生大鼠的新笼内并开始计时，记录大鼠放入到与陌生大鼠第一次主动互动的潜伏期(鼻子对鼻子互嗅或者鼻子嗅对方肛门，随后爬到大鼠背上），用来表示大鼠社交活动主动性。

1.2.3 取材 大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4℃的生理盐水经心脏冲洗后灌注4%多聚甲醛，取大脑经4%多聚甲醛后固定4～6 h，后依次经20%、30%蔗糖溶液梯度脱水，冰冻切片机冠状位连续切片，片厚10 μm，每隔5 张取1 张脑片。置于-40℃冰箱备用。

1.2.4 Neun 免疫荧光染色 随机取出冰冻切片，室温下复温，加0.3%TritonX-100，室温孵育10 min，0.01 mol/L PBS 洗3 次；加封闭液，室温孵育1 h；加单克隆小鼠抗大鼠Neun 抗体在4℃孵育16 h；0.01 mol/L PBS 洗3次，加二抗，室温避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS 洗3次；加封片剂封片；共聚焦显微镜400 倍镜下观察、拍照。使用ImageJ 软件进行细胞计数分析。

1.2.5 GFAP 免疫荧光染色 随机取出冰冻切片，室温下复温10 min，加0.3%TritonX-100，室温孵育l0 min，0.01 mol/L PBS 洗3 次；加封闭液，室温孵育1 h；加单克隆小鼠抗大鼠GFAP 抗体在4℃孵育16 h；0.01 mol/L PBS 洗3 次，加二抗，室温避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗3次；加封片剂封片；共聚焦显微镜400 倍镜下观察、拍照。使用Image J 软件进行细胞计数分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠成年后行为学评估结果

母爱剥夺组大鼠蔗糖偏爱率少于对照组大鼠，差异有统计学意义（P<0.05）；母爱剥夺组大鼠第一次主动与陌生大鼠互动潜伏期长于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 两组大鼠成年后行为学评估结果（±s）

表1 两组大鼠成年后行为学评估结果（±s）

母爱剥夺组（n=20）对照组（n=20）t 值P 值58.54±5.02 79.01±4.04 3.18 0.008 84.57±5.71 53.00±5.52 3.97 0.002组别 蔗糖偏爱率（%） 主动与陌生大鼠互动潜伏期（s）

2.2 大鼠前额叶、 海马及丘脑Neun 免疫荧光染色计数神经元

两组大鼠前额叶、 海马及丘脑Neun 免疫荧光染色结果于400 倍镜下拍照，使用Image J 软件对相同部位进行细胞计数分析。计数结果示母爱剥夺组大鼠前额叶、 海马及丘脑Neun 阳性神经细胞数少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、图1（封三）。

图1 Neun 染色结果

表2 两组大鼠前额叶、海马及丘脑Neun 染色阳性细胞计数结果（个，±s）

表2 两组大鼠前额叶、海马及丘脑Neun 染色阳性细胞计数结果（个，±s）

母爱剥夺组（n=20）对照组（n=20）t 值P 值22.35±2.71 31.24±5.49 6.25＜0.001 119.90±10.84 139.55±6.79 7.13＜0.001 32.14±5.31 40.60±6.88 5.01＜0.001images/BZ_15_212_2179_1205_2234.png

2.3 大鼠前额叶、 海马及丘脑区GFAP 免疫荧光染色结果

两组大鼠前额叶、海马及丘脑GFAP 免疫荧光染色结果于400 倍镜下拍照，计数GFAP 染色阳性的星形胶质细胞细胞数，结果显示，母爱剥夺组大鼠前额叶、海马及丘脑GFAP 染色阳性的星形胶质细胞少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3、图2（封三）。

表3 两组大鼠前额叶、海马及丘脑GFAP 染色阳性结果（个，±s）

表3 两组大鼠前额叶、海马及丘脑GFAP 染色阳性结果（个，±s）

母爱剥夺组（n=20）对照组（n=20）t 值P 值8.60±2.33 11.40±2.48 4.99＜0.001 13.10±2.17 19.70±2.20 10.08＜0.001 10.55±1.36 16.76±2.76 8.40＜0.001images/BZ_15_1275_334_2268_389.png

图2 GFAP 荧光染色结果

3 讨论

抑郁症患病率、致残率高，给患者及其家属、社会带来严重的危害和经济损失[9]。大量研究发现出生早期发育阶段的持续性应激事件可以损害大脑的结构和功能[5，10]，使其在成年后个体患抑郁症风险明显升高[11]。目前关于出生后早期应激事件增加成年后患抑郁症风险的发病机制尚不清楚，深入探讨早期母爱剥夺致成年后患抑郁症风险增加的病理机制，对于预防抑郁症具有重要的意义。

早年应激可引起的不同脑区的功能障碍，最早引起人们注意是前额叶在早期应激中的作用，后来人们逐渐发现前额叶与多个脑功能区通过双相联系在应激的易化负反馈抑制通路中发挥作用，这些脑区包括边缘系统及丘脑等[12]。研究发现早期应激与前额叶、海马等多个脑区体积减小相关[13]，经历早期应激的抑郁症患者其海马体积较没有经历早期应激的抑郁症患者显著减小[14]。有研究者提出早年应激或许是抑郁症的独立性危险因素，且与抑郁症患者大脑多个脑区的器质性异常有关[15]。

近年来研究证实抑郁症也与不同脑区、多个网络系统结构和功能改变有关联[16]，这些器质性病变主要集中在LTC 上。前额叶、海马、丘脑是LTC 的重要节点，在情绪调节和传导中具有重要的作用[17]。前额叶与情绪、记忆及执行能力等密切相关，前额叶功能异常会影响情绪、认知及行为的调节，前额叶的这种调节异常被认为是抑郁症诊断中情绪、认知及行为症状的核心机制[18]。海马区是参与情绪记忆的重要脑区，也是前额叶皮质功能的重要调节器，海马功能的异常可能与抑郁症中常见的应激调节异常、 注意力不集中及记忆障碍相关。丘脑是大脑功能信息进行整合的重要脑区，通过不同的通路与不同脑区进行联系，在情绪处理、认知及记忆中具有重要作用。大量研究发现前额叶、海马、丘脑在抑郁症患者存在明显的活动异常[19-20]。

星形胶质细胞在中枢神经系统相关疾病中具有极其重要的作用，其与抑郁症的关系也逐渐被研究者发现。有研究者提出“三重突触”概念，认为星形胶质细胞是构成突触的第三成分，参与调节神经元的兴奋[21]。星形胶质细胞与超过90%谷氨酸重吸收和代谢有关[22]。星形胶质细胞功能障碍会造成神经元的损伤，造成神经元的丢失[22]。

本研究通过早期母爱剥夺建立大鼠抑郁模型，在经过14 d 早期母爱剥夺应激后，大鼠成年后的其行为学明显出现快感缺失、社交回避等表现，很好的模拟了人类的抑郁症状，成功建立了早期母爱剥夺致成年大鼠抑郁模型。为进一步了解早期母爱剥夺致大鼠成年后抑郁的病理机制，本研究通过Neun 免疫荧光染色来标记神经元，采用GFAP 免疫荧光染色来计数星形胶质细胞数目，观察早期母爱剥夺对成年大鼠前额叶、 海马及丘脑神经元及星形胶质细胞数量的影响。结果发现早期母爱剥夺组大鼠前额叶、海马区神经元及GFAP 阳性细胞数显著少于对照组，这与之前他人的研究一致[23-24]。在实验中还观察了出生后早期母爱剥夺对丘脑神经元及星形胶质细胞数目的影响，发现母爱剥夺组大鼠丘脑神经元及GFAP 阳性细胞数目较对照组也显著减少。因此本研究推测早年母爱剥夺应激对大鼠前额叶、海马及丘脑区神经元及星形胶质细胞均造成严重的损伤，使其数目显著减少，从而影响其正常功能，致使LTC 结构和功能出现异常，从而构成大鼠成年后出现抑郁样行为学改变的病理基础。

综上所述，早期母爱剥夺可致LTC 重要组成部分前额叶、 海马及丘脑区的神经元及星形胶质细胞数目显著减少，推测LTC 可能是参与早年应激致成年后抑郁的重要病理机制。但本研究仅观察了前额叶、 海马、 丘脑区神经元及星形胶质细胞数目的改变，其具体的分子及信号机制尚不清楚，后续还需进一步研究。