RNAi介导的中华蜜蜂AcerOBP14触角电位反应

赵淑果，彭 竹，黄 丽，刘苗苗，赵慧婷

（山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）

昆虫在漫长的进化中形成了灵敏的嗅觉感受机制，利用嗅觉确定食物来源，选择产卵场地、同伴、配偶和找寻寄主及躲避天敌等。嗅觉能够探测外界环境中的各种气味分子，如信息素、植物花香及动物体表挥发物，对昆虫的生存至关重要[1]。昆虫主要通过触角上分布的各种嗅觉蛋白执行不同功能来进行嗅觉识别，各种嗅觉蛋白相互联系共同作用完成昆虫嗅觉有关的生理活动，并引起昆虫相应的行为反应。例如当昆虫的触角识别到空气环境中各种气味物质时，分布在感器淋巴液的气味结合蛋白（odorant binging proteins，OBPs）会与气味物质形成OBP-气味物质的复合体并转运到嗅觉感受神经元的树突，这时就会激活在树突膜分布的嗅觉受体（odorant receptors，ORs），最后将信号传递到中枢嗅觉系统引起昆虫的相应行为[2]。除此之外，还有化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、感觉神经元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）和气味降解酶（odorant degrading enzyme，ODEs）等[3]。OBPs 是一类可溶性蛋白，负责外界气味分子与嗅觉受体之间的联系，是嗅觉识别的关键蛋白[4]。1981年，VOGT等[5]用同位素标记法首次在多音天蚕（Antheraea polyphemus）雄性触角的毛形感器淋巴液中发现了第1 个昆虫气味结合蛋白。目前 OBPs 已在鳞翅目[6]、鞘翅目[7]、双翅目[8]、膜翅目[9]、直翅目[10]和半翅目[11]等11个目的50多种昆虫中鉴定出800多个OBPs。

蜜蜂是一种群居的社会性昆虫，属于膜翅目（Hymenoptera）细腰亚目（Apocrita）蜜蜂科（Apidae）蜜蜂属（Apis）[12]。它们与人类的生活息息相关，多种显花植物都依靠蜜蜂授粉，在提高农作物产量的同时[13]，对生态系统平衡的维持也具有重要作用[14]。此外，蜜蜂还能为人类提供各种天然健康、营养丰富的蜂产品，如所熟悉且可食用的蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉和蜂胶等[15]。蜂产品在增加人类日常饮食种类之外，对人的身体健康也有很大的益处[16]。中华蜜蜂（Apis cerana cerana）简称中蜂，是东方蜜蜂的一个亚种，是我国饲养的当家蜂种，因其具有适应低温、飞行敏捷、嗅觉灵敏、善于采集零星蜜粉源，适合山区植物传粉及抗螨抗病能力强等优点，深受广大养蜂者的欢迎[17]。

目前，中华蜜蜂气味结合蛋白的研究已经从基因水平深入到蛋白水平，利用基因克隆、重组蛋白原核表达与纯化、荧光竞争结合及RNA 干扰等技术揭示了气味结合蛋白的功能。山西农业大学蜜蜂研究团队前期克隆获得了AcerOBP14基因序列，采用生物信息学软件分析了其序列特征，采用qRT-PCR 分析了时空表达模式[18]；成功构建了Pet28a/AcerOBP14原核表达载体，诱导表达出重组蛋白，通过荧光竞争结合试验鉴定了AcerOBP14重组蛋白对13种配体物质有较强的结合能力[19]。

基于前期荧光竞争结合试验的结果，本研究通过饲喂法对中蜂采集蜂AcerOBP14基因干扰前后进行qRT-PCR 及触角电生理试验，旨在为以后深入研究中蜂嗅觉识别机制提供理论参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试中华蜜蜂饲养在山西农业大学的蜂场。于8：00—10：00 在无分蜂、无病、群势强的中蜂巢门口随机捕抓后足携带花粉的采粉蜂，用消毒镊轻轻夹住中蜂采粉蜂胸部，放至木盒中，之后将木盒置于温度为（28±1）℃、湿度为75%±5%的恒温恒湿培养箱中。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂Trizol 购自美国Invitrogen 公司；T7 RiboMAX TM Express RNAi System 购自美国Promega 公司；荧光定量试剂盒2×Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）购自北京聚合美生物科技有限公司；cDNA 合成试剂盒PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser 购自美国Omega Bio-Tek 公司；DNA 凝胶回收试剂盒Omega DNA Gel Extraction Kit 购自美国Omega Bio-Tek 公 司 ；D2000 DNA marker Ladder、核 酸 染 料GoldView、RNase-free water购自北京索莱宝科技有限公司；50×TAE Buffer购自生工生物工程（上海）有限公司；气味标品均购自阿拉丁试剂有限公司。

1.3 引物设计

利用在线工具 Primer 3（https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），输入AcerOBP14的核苷酸序列，设计2个相对分子量不同的片段。用于RNAi的对照基因是NCBI 上获得的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）（登录号：JQ064510.1）；用于qRT-PCR的内参基因是NCBI上获得的AcerArp1（登录号：HM640276.1）。表1为本试验所用的引物序列。

表1 本试验合成的引物Tab.1 Primers synthesized in this study

1.4 体外合成dsRNA

以山西农业大学蜜蜂研究团队保存的含目的基因的质粒（Pet28a/AcerOBP14）为模板进行PCR扩增。扩增之后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后参照琼脂糖凝胶试剂盒的说明回收纯化，并测定回收产物质量以备后续合成dsRNA。按照T7 RiboMAX TM Express RNAi System 说明书合成dsRNA，具体的过程：第1 步在室温的条件下合成ssRNA；第2步退火合成dsRNA；第3步dsRNA的纯化。将dsRNA的浓度测定后于-80 ℃保存待用。

1.5 dsRNA的饲喂

收集中华蜜蜂采集蜂进行dsRNA 的饲喂。RNAi试验设置：待放置于培养箱中的中蜂饥饿0.5 h后饲喂含有dsAcerOBP14-1的30%糖水的试验组、含有dsAcerOBP14-2 的30%糖水的试验组、含有dsGFP的30%糖水的试验组和只饲喂30%糖水的对照组。经过前期预试验每只中蜂需饲喂8µg 的dsRNA。一个生物学重复20只中蜂，每组3个生物学重复。置于人工培养箱温度（28±1）℃、湿度75%±5%培养。

1.6 qRT-PCR测定AcerOBP14的表达量

收集饲喂dsRNA 24、48、72、96 h的蜜蜂各6只液氮速冻，参照Trizol试剂说明书提取RNA，进行质量和浓度测定，以1µg 总RNA 为模板反转录合成cDNA。利用qRT-PCR 技术检测饲喂dsRNA 后蜜蜂体内AcerOBP14的表达情况，选取沉默效率高的AcerOBP14片段和合适的沉默时间。参照2×Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）试剂盒说明操作。反应体系为：2×Realtime PCR Super mix 7.5µL，上、下游引物（10µmol/L）各0.6µL，cDNA 模板 1 µL，ddH2O 补充至 15 µL。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，62 ℃ 34 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。选取中蜂AcerArp1基因为内参基因。每个样品进行3次技术重复。

1.7 触角电生理试验

通过山西农业大学蜜蜂研究团队前期荧光竞争结合试验筛选出13 种与AcerOBP14 重组蛋白结合能力较强的气味物质（表2），将待测的气味物质溶于石蜡中，终质量浓度为300µg/µL。按照1.5中RNAi干扰效率的分析，选取沉默效率较高的dsRNA片段（dsAcerOBP14-1）及最佳干扰时间（48 h）对目的基因再次进行沉默，然后采中蜂进行触角电位试验。用眼科剪将蜜蜂一侧触角自基部剪下后，将触角固定在涂有导电胶的金属电极上，保证触角和导电胶充分接触。移液枪吸取10µL待测样品均匀滴加在折叠成“V”形的条状滤纸（长3 cm，宽1 cm）上，将滤纸塞入巴斯德管，进行EAG测定。本试验以石蜡为对照，每根触角为1次重复，至少重复10次。

表2 供试的气味物质Tab.2 Odorant material used in this study

1.8 数据分析

通过2-ΔΔCt法对荧光定量结果Ct值进行相对表达量分析；单因素方差分析使用SPSS 25.0软件；作图采用GraphPad Prism 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 体外合成dsRNA结果分析

参照T7 RiboMAX TM Express RNAi System 试剂盒说明书体外合成AcerOBP14-1和AcerOBP14-2的dsRNA。测定浓度和质量之后，取1 µL dsRNA经20 倍稀释后电泳检测。AcerOBP14-1 的片段长度为 168 bp，AcerOBP14-2 的片段长度为 189 bp。从图1 可以看出，dsRNA 片段条带清晰，大小均与预期相一致，经核酸定量仪测定后的dsRNA用于后续基因沉默介导试验。

2.2 qRT-PCR检测结果分析

qRT-PCR 检 测AcerOBP14-1 和AcerOBP14-2在不同时间处理组中mRNA 的表达差异，确定最佳的干扰条件。从图2 可以看出，AcerOBP14-1 和AcerOBP14-2 的dsRNA 片段均能够在不同程度上降低mRNA 的表达水平。dsAcerOBP14-1 和dsAcerOBP14-2 在饲喂24、48、72、96 h 后dsRNA 的表达量均极显著低于糖水组和dsGFP组（P＜0.05），dsAcerOBP14-1 在饲喂 48 h 时沉默效果最好，沉默效率达68.9%。

2.3 触角电生理结果分析

根据2.2 中RNAi 介导的基因沉默效率的比较结果，本研究选取干扰效果较好的dsAcerOBP14-1再次饲喂采集蜂，并于饲喂48 h 后进行EAG 试验如图3所示。

由图3可知，饲喂dsRNA后的中华蜜蜂触角对2-庚酮、α-法尼烯、β-罗勒烯和柠檬醛的EAG相对值极显著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG相对值显著降低（P＜0.05），说明这几种气味物质是AcerOBP14结合特异性较高的配体物质。

3 结论与讨论

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是在动植物中广泛存在的一种序列特异性的基因表达抑制，它通过降解mRNA、抑制翻译和重构染色质来调节基因表达，是一种广泛且高效的研究昆虫发育、生殖、行为和免疫相关基因功能的试验方法[20]。目前，已在鞘翅目[21]、半翅目[22]、鳞翅目[23]、蜱螨目[24]等生物体上都得到了广泛应用。RNAi 主要有注射法、浸泡法、饲喂法、转基因、病毒感染等方式，由于饲喂法操作简单，对受试昆虫机械损伤小等原因，是较常用的一种RNAi方式。陈艺杰[25]通过饲喂法沉默意大利蜜蜂AmTO1基因，结果发现，干扰组（AmTO1）目的基因的表达量显著低于对照组；范文艳[26]通过饲喂法探究AccT5H-1基因沉默后中华蜜蜂体内抗氧化基因的表达量，结果显示，沉默后中华蜜蜂体内其他抗性基因的表达量均上调。晁玉珍[27]通过饲喂法沉默中华蜜蜂体内AccMKP3和AccApoD基因，发现有抗氧化基因的转录水平变化明显，并且POD、SOD 和CAT 这些抗氧化酶的活性也明显增加。从这些研究结果可见，通过饲喂法沉默蜜蜂体内基因的表达可以产生良好的效果。本试验通过饲喂法干扰中蜂采集蜂AcerOBP14的基因表达量，通过qRT-PCR 检测在不同时间处理组中mRNA的表达差异，最终筛选出了最佳的干扰片段及确定了最佳的干扰条件，即dsAcerOBP14-1 较dsAcerOBP14-2 沉默效果更好，且在饲喂48 h 时沉默效果最好，沉默效率达68.9%。WICHER 等[28]在对果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎进行RNA 干扰时发现，随着dsRNA 链的增长RNAi 干扰效果增强，片段长的dsRNA干扰活性较大。郭丽娜等[29]研究了中华蜜蜂气味受体AcerOr2，设计并合成了3个不同大小的dsRNA 片段进行RNAi，发现短链dsRNA 沉默效果最好。而本试验中AcerOBP14同样是片段短的dsRNA沉默效果较好，这可能是因为同源性很高的基因，长链dsRNA造成了非靶标基因沉默，故短链dsRNA的干扰效果更好。

触角电生理（EAG）可以灵敏记录昆虫触角对微量信息物的反应，通过测试刺激引起的受体电位反应值的大小可以判断刺激物对昆虫是否有活性，或者昆虫是否对刺激物产生反应，它代表了触角对所测试化合物的嗅觉灵敏度，是昆虫嗅觉、信息素生物测定研究的重要技术之一[30]。徐伟等[31]通过EAG 检测发现，β-石竹烯和芳樟醇对中华弧丽金龟甲（Popillia quadriguttata）的雌虫有明显的引诱作用；苹果小吉丁虫雌雄成虫触角对（-）-α-蒎烯、壬醛、（+）-α-蒎烯、苯甲醛、癸醛、丙烯酸丁酯产生较强触角电位反应[32]。

本研究结合前期荧光竞争结合试验的结果，选择干扰效果较好的dsRNA 片段再次饲喂中蜂采集蜂进行EAG试验。结果发现，中蜂触角对2-庚酮、α-法尼烯、β-罗勒烯和柠檬醛的EAG 反应值极显著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG 反应值显著降低（P＜0.05），法尼醇、油酸甲酯、β-石竹烯、亚麻酸、（+）-3-蒈烯、1-辛醇和丁香酚的EAG反应值变化不显著。研究表明，2-庚酮是一种报警信息素，当工蜂成为守卫蜂或采集蜂时，它们的上颚腺就能产生类似干乳酪气味的化合物2-庚酮。蜂群发生盗蜂或有其他蜂王入侵时，守卫蜂或采集蜂就会产生2-庚酮这种危险的信号，接受到信号的本群工蜂也分泌这种信息素，召集富于攻击性的工蜂以驱赶入侵者保护蜂巢[33]。橙花醇和柠檬醛属于那氏信息素，它是由工蜂那氏腺分泌的、具有特殊气味的信息化学物质，在蜜蜂的许多活动中起引导和定向作用有利于工蜂确定巢位[34]。NICHOLAS等[35]研究发现，橙花醇对工蜂具有高度吸引力。另外，那氏腺分泌物可以调节分蜂及蜂群移动，还能够吸引散团的工蜂重新集结[36]。因此，推测AcerOBP14可能参与蜂群的有序进行，对蜂群的稳定起到重要作用。有研究发现了另一种蜜蜂幼虫信息素β-罗勒烯，它有抑制蜜蜂工蜂的卵巢成熟，提高工蜂采粉行为及增加哺育蜂访问巢房频率的作用[37]。吴帆[38]通过EAG试验发现，浆蜂和意蜂哺育蜂触角可以在3 ms 内识别幼虫挥发物β-罗勒烯，浆蜂哺育蜂对低浓度的β-罗勒烯有很强的反应，说明浆蜂哺育蜂对幼虫挥发性信息素β-罗勒烯识别很灵敏。这对于工蜂饲喂幼虫发挥着关键性作用，工蜂可以根据β-罗勒烯这种信号调节幼虫食物分配。另外，β-罗勒烯还是兰科石斛花的重要成分，胡椒酮和α-法尼烯也属于植物花香挥发物，它们的花香在蜂蝶类授粉中发挥着重要作用。由此推测，AcerOBP14可能参与工蜂的采集、幼虫食物分配等相关行为。然而，对于蜜蜂这种具有高度社会性特征的群体，参与其生命活动的一些行为不单单由一个基因调控，需要多个基因协同作用，因此，了解OBPs在蜜蜂行为活动中承担的角色，对探究蜜蜂嗅觉分子机制具有重要的作用。

综上所述，中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14-1和AcerOBP14-2 的dsRNA 片段均能在不同程度上降低目的基因mRNA表达水平。dsAcerOBP14-1有较好的沉默效果，且在饲喂48 h 时沉默效果最好。EAG 试验表明，中蜂触角对2-庚酮、α-法尼烯、β-罗勒烯和柠檬醛的EAG反应值在饲喂dsRNA前后极显著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG 反应值显著降低（P＜0.05）。推测AcerOBP14可能参与了工蜂采集、幼虫食物分配及蜂群秩序维护等相关行为。