体外模拟消化对桑葚酸奶酚类化合物稳定性和抗氧化活性的影响

曹红妹，胡桂萍*，蔡 翔，石旭平，叶 川，王 丰，胡丽春，王亚威

（1.江西省蚕桑茶叶研究所，江西 南昌 330202；2.江西省经济作物研究所，江西 南昌 330202；3.江西省蚕桑工程技术研究中心，江西 南昌 330202）

桑葚又称桑果、桑子等，是桑科落叶乔木桑（Morus alba L.）的成熟果实［1］，其富含有机酸、糖分、游离氨基酸、矿物质及微量元素［2］，还含有丰富的花青素、芦丁、白藜芦醇等多种功能性成分。据《中国药典》（2010年版一部），桑葚中药材标准中记载其具有安神明目、滋阴补血、抗氧化、防癌抗癌等多种功效，被原国家卫生部认定为“药食同源”的农产品之一［3］。当前，桑葚被开发加工成不同产品，包括桑葚果粉、桑葚汁、桑葚膏、桑葚果醋、桑葚酒、桑葚酸奶等［4-5］，其中桑葚酸奶通过桑葚和酸奶共发酵制得，桑葚和酸奶均为大众较喜爱的两类健康饮品，其体系内活性物质丰富且氧化活性稳定，因而桑葚酸奶产品兼具桑葚和酸奶的营养保健效果于一身，在大众对多元化功能饮品高标准的需求形势下，桑葚酸奶逐渐成为新宠，具有较高的研究价值和市场潜力［6］。

研究资料表明，桑葚中含有丰富的天然抗氧化组分，如多酚、黄酮等活性成分，在清除自由基、延防衰老等方面显示出积极的作用［7］。在人体内，酚类物质必须经过消化吸收后才能作用于目标细胞或组织，发挥其有益作用［8］。但是，胃肠消化环境也会不同程度地对多酚类物质的稳定性产生影响，同时改变其抗氧化活性［9］。如李亚等［10］研究表明蓝莓经模拟胃肠消化后其总黄酮、总多酚及ABTS+•自由基清除能力均高于消化前水平，而花色苷含量则变化不大；赵永波等［9］研究蓝莓酸奶在消化过程中酸奶中多酚类物质的稳定性及抗氧化活性时，得出蓝莓酸奶经胃肠消化后其多酚类物质被释放、抗氧化活性增强的结论，具体表现为消化前，蓝莓酸奶的各项指标均低于蓝莓果料；体外消化后，除了蓝莓酸奶的DPPH•自由基清除能力和总黄酮含量低于蓝莓果料外，总抗氧化、总酚、花色苷含量以及ABTS+•清除能力均高于蓝莓果料。

食物中酚类物质的稳定性是决定其抗氧化活性和吸收利用的关键前提［11］。有研究表明，体外消化法可在生理条件下通过模仿体内环境pH值、盐的种类与浓度、消化酶的作用、消化时间和温度等因素，模拟食物的消化过程，该方法在食品科学领域得到了广泛的研究与应用［8］。而桑葚酸奶体系内酚类物质稳定性及抗氧化活性受消化过程的影响程度尚未见报道。因此，本试验以桑葚酸奶、桑葚原汁和酸奶为研究对象，建立口腔、胃、肠体外模拟消化模型，研究消化对各样品酚类物质的稳定性及抗氧化活性的影响，以期为桑葚酸奶在营养功能食品中的推广应用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

速冻桑葚由江西省蚕桑茶叶研究所的蚕桑课题组提供；脱脂乳为市售蒙牛品牌脱脂乳；酸奶发酵剂为直投式酸奶发酵剂［嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(德氏乳杆菌保加利亚亚种)］，由北京川秀科技有限公司提供；蔗糖和果胶为市售食品级；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、DPPH•、ABTS+•等为美国Sigma公司产品；牛胆盐产自国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸Vc（纯度99.7%）、没食子酸（纯度99%）产自天津市光复精细化工研究所；芦丁（纯度95%） 产自上海金穗生物科技有限公司；福林酚试剂产自北京索莱宝科技有限公司；甲醇、冰乙酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、无水乙酸、盐酸、亚硝酸钠、碳酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化钾、无水乙酸钠、铁氰化钾、三氯化铁等均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

Varioskan LUX多功能酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；快速漩涡混匀器（金坛市中大仪器厂）；GL-21M高速冷冻离心机（Thermo scientific公司）；FA2004电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；FE20实验室pH计［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；XMTD-204数显恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司）；hz-82震荡型数显恒温水浴锅（金坛新航有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备 （1）桑葚果汁的制备：参考Ścibisz等［12］的方法并略有改动。将速冻桑葚（60%）、蔗糖（35%）、变性淀粉（2%）、水（2.4%）和果胶（0.6%）混匀并倒入料理机磨浆，经过80目细纱网过滤果柄和果渣后获得原汁桑葚果汁，再使用100 mL旋盖玻璃瓶灌装好，进行杀菌（85 ℃、15 min）处理，待冷却后置于4 ℃冰箱冷藏备用。

（2）酸奶制备：参考Trigueros等［13］方法并略有改动。脱脂乳和蔗糖按照100∶5的比例加入蔗糖，随后搅拌均匀至蔗糖全部融化，再将其进行杀菌（85 ℃、15 min）处理，待冷却至30 ℃后按照5%的接种量加入酸奶发酵剂，37 ℃条件下黑暗恒温发酵约24 h，至pH值低于4.7后终止发酵，冷却至室温，保存备用。

（3）桑葚酸奶的制备：参考胡桂萍［14］的方法并略有改动，将桑葚果汁和（2）中制备的酸奶以1∶4比例混合，在无菌条件下混匀并灌装于灭菌玻璃瓶中，获得桑葚酸奶成品。

试验设置2组样品，1组为试验组，另1组为对照组，各组样品包括等质等量的桑葚酸奶（20%桑葚果汁+80%酸奶）、桑葚果汁（20%桑果汁+80%去离子水）和酸奶（20%去离子水+80%酸奶），各组样品分别设置3个重复；将两组试验样品放在完全相同的贮藏条件下贮藏48 h后，对试验组和对照组各样品进行体外模拟消化试验。

1.3.2 模拟消化 体外连续模拟消化试验参考Oliveira等［15］的方法并略有改动。分别称取各个试验消化样品10 g置于不同的50 mL离心管中，依次加入0.9%的NaCl溶液10 mL进行稀释处理，同时调节消化样品溶液pH值分别进行模拟口腔（1 min）、胃（1 h）和肠（2 h）的消化。

1.3.2.1 模拟口腔消化 试验组：先将α-淀粉酶溶于1 mmol/L CaCl2溶液，酶活力为100 U/mL制成模拟唾液待用，再调整各试验消化样品的pH值为6.0（使用1 mol/L NaHCO3溶液），最后将0.3 mL模拟唾液添加至pH值为6.0的各试验消化样品中，在37 ℃、200 r/min条件下消化1 min，用冰水浴冷却结束反应。

对照组：调整各试验消化样品的pH值为6.0（使用1 mol/L NaHCO3溶液）后，用1 mmol/L CaCl20.3 mL替代模拟唾液，其他处理同上。

1.3.2.2 模拟胃消化 试验组：将250 mg胃蛋白酶溶于10 mL 0.1 mol/L HCl中制成模拟胃液，再使用1 mol/L HCl溶液调整各组模拟口腔消化后样品的pH值至2.0，然后在pH值为2.0的各试验消化样品中添加模拟胃液，添加比例为0.05 mL/g消化样，在37 ℃、100 r/min条件下分别消化0、30、60 min，冰水浴冷却以终止反应。

对照组：使用1 mol/L HCl溶液调整各组模拟口腔消化后样品的pH值至2.0后，用0.1 mol/L HCl替代模拟胃液，其他处理同上。

1.3.2.3 模拟肠消化 试验组：将40 mg胰蛋白酶和250 mg牛胆盐溶于10 mL 0.1 mol/L NaHCO3制成模拟肠液，再调整各组模拟口腔和胃消化后样品的pH值至6.0（使用1 mol/L NaHCO3溶液），然后在pH值为6.0的各试验消化样品中添加模拟肠液，添加比例为0.125 mL/g消化样，在37 ℃、100 r/min条件下分别消化0、60、120 min，冰水浴冷却终止反应。

对照组：使用1 mol/L NaHCO3溶液调整各组模拟口腔和胃消化后样品的pH值至6.0，用0.1 mol/L的NaHCO3溶液替代模拟肠液，其他同上。

1.3.3 各样品提取液的制备 经消化试验后，各样品提取液的制备参考Cebeci等［16］方法并略有改动。取桑葚酸奶10 g置于50 mL的离心管中，加15 mL含0.05 mL浓盐酸的酸化甲醇，先12000 r/min离心机提取1 min，再-20 ℃静置1 h使蛋白充分沉淀后，在4℃、7000 r/min条件下离心10 min，取上清液用于多酚类物质含量和体外抗氧化活性测定。

1.3.4 酚类物质含量的测定 总多酚含量的测定采用福林-酚法［13］，以没食子酸标准品作曲线计算多酚的含量（y= 6.17151x+0.0408342，R2=0.999，单位：mg/100 g）；总黄酮含量的测定参考蔡萌等［17］的方法，以芦丁为标准曲线计算黄酮含量（y=0.585034x-0.0144429，R2=0.999，单位：mg/100 g）。

1.3.5 抗氧化活性的测定 ABTS+•清除能力的测定参考Re等［18］的方法（标准曲线y=0.009x+0.076，R2=0.992）；DPPH自由基清除能力的测定参考Shen Y B等［19］方法（标准曲线y=2.460x-0.230，R2=0.993）；总抗氧化活力的测定参考Berker等［20］方法（标准曲 线y= 5.33653x+0.00988779，R2=0.999），均 以Vc（0.025～0.120 mg/mL）为标准品作标准曲线，结果用每百克干样品中Vc当量表示（mg/100 g）。

1.4 数据处理

用Sigmaplot 12.5软件作图；用SPSS Statistics 17.0软件进行数据分析，用Duncan检验进行数据的显著性分析，P＜0.05表示差异显著；用Microsoft Excel（2016版）软件分析数据的相关性。

2 结果与分析

2.1 体外消化过程中桑葚酸奶总多酚含量的变化

由表1可知，相对于消化前，模拟口腔消化过程，试验组和对照组各样品的总多酚含量无显著影响（P＞0.05），模拟胃肠消化均可促进样品总多酚物质的释放。试验组消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的总多酚含量分别为53.73、35.46、7.91 mg/100 g。模拟胃消化过程中，试验组桑葚酸奶的总多酚含量在60 min结束时各样品的总酚含量较消化前的含量分别提高了176.47%、95.48%、49.18%（P＜0.05），显著高于桑葚果汁和酸奶。对照组中各样品的总酚含量呈现不同的变化趋势，其含量在胃消化结束时较消化前分别提高了23.88%、降低了1.58%、降低了19.60%（P＞0.05），变化幅度均低于试验组。模拟肠消化过程中，试验组较对照组变化更明显：试验组桑葚酸奶和桑葚果汁均在肠消化60 min时达到最高值，分别为185.02、84.19、15.46 mg/100 g，且到120 min结束时各样品的总酚含量较消化前的含量分别提高了216.38%、102.31%、94.55%（P＜0.05）；对照组中各样品的总多酚含量保持在相对稳定水平，相较消化前，肠消化结束时总多酚含量分别提高了14.24%、降低了5.10%、降低了43.23%（P＞0.05）。

2.2 体外消化过程中桑葚酸奶总黄酮含量的变化

由表2结果可知，相对于消化前，模拟口腔过程，试验组和对照组各样品的总多酚无显著影响（P＞0.05），模拟胃消化能够促进黄酮物质的释放，总黄酮物质在模拟肠消化环境中较为稳定，并且桑葚酸奶的总黄酮含量高于桑葚果汁和酸奶。试验组中消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的总黄酮含量分别为56.86、65.97、11.83 mg/100 g。模拟胃消化过程中，试验组桑葚酸奶的总黄酮含量均超过桑葚果汁和酸奶，且在60 min时桑葚酸奶的总黄酮含量较消化前的含量提高比例最高，为70.64%。对照组中各样品的总黄酮含量均保持在相对稳定水平，胃消化结束时各样品的总黄酮含量较消化前的含量分别提高了10.22%、3.94%、降低了4.73%（P＞0.05），提升幅度均低于试验组。模拟肠消化过程中，试验组桑葚酸奶总黄酮含量在60 min时达到最大值，为117.79 mg/100 g，60~120 min趋于平稳，桑葚果汁和酸奶在肠消化过程中总黄酮物质含量均保持在相对稳定水平，肠消化结束时较消化前，3种样品总黄酮含量分别提高了105.03%、14.36%、16.65%（P＜0.05）；对照组中各样品的总黄酮含量保持在相对稳定水平，肠消化结束时各样品的总黄酮含量较消化前的含量分别提高了15.27%、4.49%、降低了1.69%（P＞0.05），提升幅度均低于试验组。

表2 体外消化处理对各样品总黄酮含量的影响

2.3 体外消化过程中桑葚酸奶总抗氧化活性的变化

由图1可以看出，模拟胃肠消化可有效促进桑葚酸奶和桑葚果汁总抗氧化活性成分的释放。消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的总抗氧化活力 分 别 为67.55、52.21、13.06 mg/100 g，经 模 拟口腔消化，各样品的总抗氧化活力与消化前无显著差异（P＞0.05）。在模拟胃消化过程中，试验组桑葚酸奶在30~60 min的总抗氧化活力值和增幅均反超桑葚果汁，在60 min结束时各样品的总抗氧化活力较消化前分别提高了55.47%、94.99%、57.83%（P＜0.05）。对照组中各样品的总抗氧化活力略呈下降趋势并保持在相对稳定水平，胃消化结束时仅桑葚果汁的总抗氧化活力较消化前提高了6.34%，而其他样品均呈现下降趋势（P＞0.05），变化幅度均低于试验组。在模拟肠消化过程中，试验组桑葚酸奶总抗氧化活力在60 min时达到最大值为113.56 mg/100 g，60~120 min时略微下降，桑葚果汁和酸奶在肠消化过程中总抗氧化活力均略呈下降趋势并保持在相对稳定水平，肠消化结束时较消化前含量分别提高了44.24%、74.68%、7.54%（P＜0.05）。对照组中各样品的总抗氧化活力保持在相对稳定水平，肠消化结束时各样品的总抗氧化活力较消化前的分别降低了4.84%、提高了3.73%和降低了9.73%（P＞0.05），提升幅度均低于试验组。

图1 体外消化处理对各样品总抗氧化能力的影响

2.4 体外消化过程中桑葚酸奶ABTS+•自由基清除能力的变化

由图2可以看出，模拟胃肠消化均可促进各样品ABTS+•自由基清除能力的释放，但是肠消化的释放能力弱于胃消化过程，口腔消化对各样品的ABTS+•自由基清除能力无显著影响（P＞0.05）。在消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的ABTS+•自由基清除能力分别为57.68、75.57、9.22 mg/100 g。在模拟胃消化过程中，试验组桑葚酸奶的ABTS+•自由基清除能力在0~60 min均持续显著提高（P＜0.05），至60 min时达到最高值为123.27 mg /100 g，提高的百分率最高，为113.70%（P＜0.05）。对照组中各样品的ABTS+•自由基清除能力保持在相对稳定水平，胃消化结束时各样品的ABTS+•自由基清除能力较消化前的含量分别提高了7.35%、10.57%、27.19%（P＞0.05），提升幅度均低于试验组。在模拟肠消化过程中，试验组各样品的ABTS+•自由基清除能力均呈现下降变化，肠消化结束时较消化前ABTS+•自由基清除能力分别提高了42.73%、30.73%、2.96%（P＜0.05）；对 照 组 中 各 样 品 的ABTS+•自由基清除能力保持在相对稳定水平，肠消化结束时各样品的ABTS+•自由基清除能力较消化前分别提高了2.77%、6.09%、0.31%（P＞0.05），提升幅度均低于试验组。

图2 体外消化处理对各样品ABTS+•自由基清除能力的影响

2.5 体外消化过程中桑葚酸奶DPPH•自由基清除能力的变化

由图3可以看出，模拟胃肠消化均可促进各样品DPPH•自由基清除能力的释放，释放能力表现为胃消化过程强于肠消化过程，模拟口腔1 min对各样品的DPPH•自由基除能力无显著影响（P＞0.05）。试验组在消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的DPPH•自由基清除能力分别为44.61、62.57、6.29 mg/100 g。在模拟胃消化过程中，桑葚酸奶DPPH•自由基清除能力在0~60 min持续显著升高（P＜0.05），并在30~60 min过程中超过在桑葚果汁的DPPH•自由基清除能力，60 min时达到最高值为86.11 mg/100 g；胃消化结束时各样品的DPPH•自由基清除能力较消化前分别提高了93.03%、17.30%、173.69%（P＜0.05）。对照组中各样品的DPPH•自由基清除能力保持在相对稳定水平，胃消化结束时各样品的DPPH•自由基清除能力较消化前的含量分别提高了11.16%、6.76%、0.89%（P＞0.05），提升幅度均低于试验组。在模拟肠消化过程中，试验组各样品的DPPH•自由基清除能力均呈现下降变化，桑葚酸奶的减弱速度最慢，且仅桑葚酸奶在肠消化结束时较消化前DPPH•自由基清除能力提高了22.49%（P＜0.05），桑葚果汁和酸奶的分别下降了30.54%、15.59%（P＜0.05）。对照组中各样品的DPPH•自由基清除能力保持在相对稳定水平但均呈现下降变化，肠消化结束时各样品的DPPH•自由基清除能力较消化前分别下降了10.07%、1.44%、1.86%（P＞0.05），提升幅度均低于试验组。

图3 体外消化处理对各样品DPPH•自由基清除能力的影响

2.6 相关性分析

由表3可知，桑葚酸奶的总多酚和总黄酮与总抗氧化活力呈极显著相关（P＜0.01），相关系数分别为0.962和0.891；桑葚酸奶的总多酚和总黄酮与ABTS+•自由基清除能力、DPPH•自由基清除能力的相关性系数在0.202~0.479范围内，无显著相关性（P＞0.05）。桑葚果汁的总多酚与总抗氧化活力呈显著相关性（P＜0.05），总黄酮与DPPH•自由基清除能力的相关性系数为-0.09，呈现负相关性，其余则无显著相关性（P＞0.05）。酸奶的总多酚、总黄酮与总抗氧化活力、ABTS+•自由基清除能力的相关系数在0.093~0.538，无显著相关性（P＞0.05）；酸奶的总多酚、总黄酮与DPPH•自由基清除能力的相关系数则分别为-0.433和-0.218，呈现负相关性。因此，桑葚酸奶总多酚和总黄酮与总抗氧化活力密切相关，是其主要抗氧化活性成分；桑葚果汁总多酚与总抗氧化活力密切相关，是其主要抗氧化活性成分。

表3 各样品中多酚类物质及抗氧化活性的相关性分析

3 结论与讨论

以桑葚为原料制成的酸奶，不仅提高了酸奶制品的风味，还更具抗氧化、调节机体免疫力、预防心血管疾病、降低胆固醇、增加钙元素吸收、促进肠胃消化等多种生理功能［7］。本研究结果显示：桑葚酸奶中酚类物质在模拟体外消化过程中稳定性好，且经过相关性分析发现，桑葚酸奶的总多酚和总黄酮与总抗氧化活力呈极显著相关性（P＜0.01），相关系数分别为0.962和0.891，表明桑葚酸奶总多酚和总黄酮与总抗氧化活力密切相关，是其主要抗氧化活性成分。

本研究结果与封易成等［21］的研究的结果基本保持一致，即胃消化可促进抗氧化活性物质的释放且酚类物质稳定性好，肠消化对酚类物质和抗氧化活性物质的释放作用逐渐减弱。具体表现为，模拟胃消化过程中试验组桑葚酸奶相较于消化前和对照组，总多酚、总黄酮、总抗氧化、ABTS+•自由基清除能力及DPPH•自由基清除能力均显著提升（P＜0.05），表明模拟胃消化能够促进各样品中酚类物质的释放，并且桑葚酸奶和桑葚果汁的总酚含量均高于蓝莓果汁，可能是由于在胃酸和胃蛋白酶的作用下，有利于酚类物质从果胶、蛋白等交联作用中释放，并从结合态转化为游离态［22］；模拟肠消化过程中试验组桑葚酸奶的酚类物质与抗氧化活性物质含量均高于消化前和对照组含量，可能是由于到达肠消化过程时桑葚酚类物质部分发生降解，桑葚酸奶中的乳铁蛋白在胰蛋白作用下进一步水解并释放水溶性蛋白，或者酸奶基质促进了桑葚酚类物质的释放，弥补了桑葚多酚的损失，促使肠消化过程酚类物质含量仍保持较高水平［23］，但总多酚、总黄酮和总抗氧化活力在肠消化过程中均呈现先升高后下降的变化，ABTS+•自由基清除能力及DPPH•自由基清除能力在肠消化过程中均呈现持续下降的变化，可能是由于肠道中的胰蛋白酶对桑葚酸奶中的酚类物质和抗氧化活性物质的释放作用逐渐减小，甚至在肠消化中后期会降低桑葚酸奶中的酚类物质和抗氧化活性物质的含量。

因此，体外模拟消化处理可明显影响桑葚酸奶中酚类物质的稳定性及其抗氧化活性，且胃肠环境对其影响较大。这可能与胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆盐及胃肠环境pH值的变化产生的直接或间接影响有关［24］。若要实现桑葚酸奶在营养功能食品中的推广应用，还需对桑葚酸奶的代谢途径、生物利用率等相关机理开展进一步探究。