外泌体多角度调节骨平衡治疗骨质疏松症的研究进展

李 宁，王小强△，谢兴文，徐世红，姜朝阳，李 辉，张旭明

（1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学附属医院，甘肃 兰州 730030；4.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050）

“骨质疏松症”一词的意思是“多孔骨”，实际上是一种世界性的高发性代谢性骨病。其特点是骨量减少，骨脆性增加，微结构骨组织恶化。它的发生是由于骨形成和骨吸收之间的不平衡。虽然在所有种族、性别和年龄群体中都有发现，但多见于女性和老年人。直至提出这是一种由于轻微中风导致的骨折的疾病之后，才有了骨质疏松这一解释。它被认为是与骨折和其他严重的次要健康问题有关的最常见的人类疾病之一。根据国家骨质疏松症基金会（NOF）最近的报告，全世界50岁以上的人群中，每2名女性和1/4的男性在他们的余生中会因骨质疏松症而发生骨折。目前治疗骨质疏松症症状主要是药物治疗，如六味地黄丸、补骨脂素等。虽然这些药物治疗取得了一定的效果，但没有一种治疗方法是完全令人满意的，迫切需要一种新的高效、快速的治疗技术。为了弥补这一不足，目前的研究引入了基因靶向治疗，主要集中于靶向骨骼干细胞和成骨细胞的功能，已证实其能有效促进骨形成[1]。间充质干细胞（MSCs）的成骨分化和外泌体对于骨质疏松症的治疗具有重要意义。

1 间充质干细胞及其外泌体的现代研究

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）是一种多功能的基质细胞，具有在体内外分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力；是一种具有多种功能的干细胞，具有多分化潜能和免疫调节作用，可有效延长移植物的生存时间，调节炎症反应，从而促进组织修复[2-3]。间充质干细胞向成熟成骨细胞的募集、增殖和分化受到多种因素的调控，包括细胞因子、全身激素、生长因子和其他调节因子。自噬可促进间充质干细胞的产生，是一种必要的细胞代谢途径，在饥饿或氧化应激刺激下，通过清除受损的大分子和细胞器来维持细胞质内稳态，维持细胞的生存和生长[4-5]。自噬在恶劣条件下通过清除活性氧（ROS），帮助细胞成分循环，促进间充质干细胞成骨，维持骨重塑[6-7]。SATB2是一种特异的成骨细胞分化的免疫组化生物标志物，已被证明对骨和软组织肿瘤[8]都有用。有证据表明SATB2与间充质干细胞功能、成骨活性和骨质疏松症密切相关[9-11]。这就意味着可通过SATB2调节间充质干细胞功能、成骨活性，从而治疗骨质疏松。最近，人们发现MSCs通过分泌生长因子等小颗粒介导的旁分泌作用发挥其治疗作用。MSCs释放的胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）参与了组织再生，并参与了MSCs的旁分泌作用。

外泌体是大多数细胞类型（如MSCs、树突状细胞、巨噬细胞、上皮细胞、B细胞、T细胞等）分泌的EVs中最小的亚群。它们也可以在大多数体液中被识别，包括血液、尿液、羊水、血清等。和细胞一样，外泌体由脂质双分子层组成，可以包含许多细胞的分子成分，如蛋白质、miRNAs、DNA等。目前，分离外泌体最常用的方法包括超离心法和免疫珠分离。通过电子显微镜发现外泌体是囊泡，呈球形或特殊的杯状形态[12-13]。EV是包膜的囊泡，有几种不同的囊泡形式。哺乳动物细胞可以释放不同类型的EV。主要类型包括凋亡小体、微泡和外泌体。外泌体是EV的主要亚类之一，具有内泌体起源。外泌体是小的（301 00 nm）细胞外纳米大小的囊泡，起源于多种细胞类型中多囊体的内部囊泡，如肿瘤细胞、t细胞、肥大细胞和树突状细胞等。最近的研究发现，外泌体在一些疾病如炎症性疾病、心血管疾病、代谢性和神经退行性疾病等方面具有多种多样的治疗应用。外泌体作为特化的膜囊，保护miRNA不被降解，并将其在细胞间转移以调节细胞间的信息传递。

2 骨质疏松症病因及其与MSCs衍生外泌体的联系

骨质疏松症的发病机制是骨形成的功能损害，这是一个比较传统的说法。然而，骨质疏松症的病因复杂，并不单一：破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成之间的不平衡;成骨分化减少；脂肪分化增加等因素皆可引起该病。骨质疏松症与血管生成也密切相关。从动物、细胞和患者的研究中积累的证据表明，局部血供或血管生成的减少有助于骨质疏松症的发生。此外，miRNAs介导机制的解除也成为骨质疏松症[14]等骨相关疾病的重要病理因素。骨质疏松症的发病机制与成骨细胞和破骨细胞活性失衡有关。由于成骨细胞和脂肪细胞具有共同的前体，在衰老过程中，MSCs的细胞系向骨髓中的脂肪细胞转移，导致骨质疏松症。

MSCs的数量多少决定着所分化的子细胞的数目，而MSCs分化是一个复杂的过程;许多因素影响间充质干细胞向成骨细胞或脂肪细胞的分化，以及骨质疏松条件下的骨形成。所谓骨质疏松症与血管生成密切相关，笔者认为其本质是MSCs衍生的外泌体对血管生成起着决定性作用。此外，MSCs衍生外泌体还可通过调节脂肪细胞间接治疗骨质疏松。

3 多角度调节骨稳态

3.1 外泌体的成骨与破骨作用

Ma等[15]的研究表明，从生物结构上讲，间充质干细胞的成骨分化是骨质疏松症治疗的关键。MSCs对于骨质疏松症患者可起到直接或间接的作用。Yang[16]等研究发现LncRNA MALAT1由骨髓源间充质干细胞分泌的外泌体穿梭，通过介导microRNA-34c/SATB2轴减轻骨质疏松症；Corrado等研究的一项关键发现表明，BMSCs-derived的外泌体转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）可能促进成骨细胞活性。外泌体能够主动地在miRNAs、蛋白质和mRNA之间运输和传递信息到靶细胞，从而影响其行为，强烈地改变整个微环境。Sun等[17]的研究表明来自破骨细胞的含miRNA的外泌体选择性地抑制成骨细胞活性，使得成骨细胞数目大于破骨细胞。研究表明[18-19]，成骨细胞来源的外泌体调节破骨细胞活性，外泌体在骨微环境和骨代谢中发挥作用。

有研究结果表明，来自骨髓间质干细胞的外泌体miR-31a-5p通过靶向RhoA的30UTR并抑制其活性来促进破骨细胞的分化，由外泌体包装的BMSC来源的miR-31a-5p不仅影响成骨分化，而且通过外泌体在细胞之间的穿梭影响破骨分化。这一双重调控表明，miR-31a-5p在衰老过程中的骨形成和骨吸收中起着重要的调节作用。MSCs来源的外泌体在骨质疏松症治疗中的作用骨形成是骨质疏松症发病的关键过程，促进骨形成对骨质疏松症的治疗具有重要意义。MSCs来源的外泌体可增强体外rBMSCs-OVX成骨细胞ALP活性，上调成骨细胞基因mRNA和蛋白表达。同时，MSCs衍生的外泌体也可以刺激去卵巢大鼠中临界大小颅骨缺损的骨再生。此外，间充质干细胞衍生的外泌体可与I型胶原、纤维连接蛋白等基质蛋白结合，并诱导体外和体内的成骨细胞分化。有趣的是，除了MSCs来源的外泌体外，当与-TCP支架结合时，TCP的成骨活性可以通过激活PI3K/Akt信号通路而增强。考虑到MSCs来源的外泌体在体内和体外的成骨能力，来自MSCs的外泌体可能是有希望改善骨骼疾病如骨质疏松症的骨形成的囊泡。

3.2 外泌体促血管生成继而促进骨再生

血管生成是从原有的血管中萌发出新的血管的过程。越来越多的证据表明，局部血供或血管生成减少在骨质疏松中起重要作用。因此，促进血管生成是促进骨质疏松性骨再生的基本策略。各种研究已经证明了MSCs衍生的外泌体对血管生成关键步骤的影响。有发现hiPSC-MSCs来源的外泌体可直接促进HUVECs成纤维细胞的血管生成和胶原合成。同样，另一项研究得出结论，MSCs衍生的外泌体可以激活血管生成相关的分子表达（如PGF），促进HUVECs迁移和管形成。此外，血管生成在许多生理过程中起着至关重要的作用，它需要内皮细胞与周围环境的紧密相互作用。MSCs来源的外泌体可能通过靶向治疗。MSCs来源的外泌体可以通过促进内皮细胞尖端细胞的形成来调节内皮细胞的血管生成。总之，MSCs来源的外泌体作为促血管生成因子可能是治疗骨质疏松症的一个有希望的候选因子。

3.3 MSCs源性脂肪细胞调节骨关系

在骨髓中，成骨细胞和脂肪细胞有一个共同的前体细胞MSCs。积累的信息表明，骨质疏松症使骨髓间充质干细胞的命运偏向于脂肪细胞而不是成骨细胞，并随着骨髓脂肪的堆积而减少骨量。Martin等人发现，人间充质干细胞（HMSCs）来源的脂肪细胞可以分泌包含成脂特异性mRNA（如瘦素、ppparg、CEBPa和CEBPd转录本）和抗成骨miRNAs（miR30c,miR-31,miR125a,miR-125b,miR-138）的外泌体，并可转移到MSCs来源的成骨细胞。MiR-30c和miR-31靶向成骨转录本RUNX2和Osterix，调节成骨分化。miR-125a和miR125b在人脂肪源性干细胞成骨分化过程中显著下调。miR-138调节hMSCs的成骨分化，过表达miR-138减少骨形成[20]。由于miR-30c、miR-31、miR-125a、miR-125b和miR-138具有抑制成骨细胞基因表达的能力，本研究中miR-30c、miR-31、miR-125a、miR-125b和miR-138的表达均有所增加。这些结果可能暗示外泌体中的miRNA可能抑制成骨分化。这些发现表明，MSCs来源的外泌体可能是骨质疏松症治疗中调控成骨细胞和脂肪细胞之间关系的靶成分。

3.4 外泌体调节免疫达到骨稳态

骨修复的过程需要炎症反应，因为免疫系统会对多种细胞因子做出反应，这些细胞因子招募并激活多种类型的细胞，如MSCs，以促进骨形成。据报道，MSCs分泌的外泌体有助于免疫系统的调节。炎症失调导致骨吸收增加和骨形成抑制。T细胞已被确定为不同疾病（如骨质疏松症）中破骨细胞和成骨细胞形成及活性的关键调节因子。MSCs来源的外泌体对T细胞的分化、增殖和激活具有抑制作用：MSCs来源的外泌体可能调节免疫系统并影响骨代谢，提示MSCs来源的外泌体在无细胞治疗骨质疏松症中的潜在临床应用。

4 总结与展望

人类骨骼是一个代谢活跃的组织，在整个生命过程中经历不断的更新和重塑。在稳态条件下，成骨细胞介导的骨再生和破骨细胞介导的骨吸收之间存在微妙的平衡。这一过程的异常可产生多种骨骼疾病。使用MSCs衍生的外泌体有几个优势。第一，避免了可能导致DNA突变或损坏的细胞的转移;第二，囊泡较小且易于循环；第三，外泌体不含MHCI蛋白，可以克服细胞移植治疗的一些缺点；第四，MSCs来源的外泌体不像细胞那么复杂，因此它们更容易产生，也有可能避免一些在MSCs中面临的调控问题。综上所述，MSCs衍生的外泌体可能在不久的将来成为治疗骨质疏松症等骨骼疾病的理想工具。