miR-33参与动脉粥样硬化的调控靶点分析及中药干预研究❋

张 玮，董缙芸，李雯雯，王新杰，吴建萍

(郑州大学第一附属医院中医科，郑州 450052)

目前，心脑血管疾病仍严重威胁着人类的健康。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种常见的动脉硬化性血管疾病，通常以血管内皮损伤为始点，伴随着炎症、免疫反应以及脂质浸润等多过程[1]。微小RNA(microRNA, miRNA)是高度保守的小分子非编码RNA，通过与靶基因mRNA的3'UTR非翻译区互补配对参与基因表达的调控，参与多种系统的生理病理过程，包括肿瘤、心脑血管、神经、内分泌等[3，4]。研究显示，miR-33在调节平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞等方面发挥着重要作用，调控AS发生发展的各个阶段。因此，miR-33可能成为AS的诊断、鉴别诊断、危险分层及预后判断的新型生物标志物。大量中医药研究发现，miR-33与AS的脾虚痰浊证、气虚血瘀证等证型密切联系，中药复方或单体可通过抑制miR-33改善炎症和脂质代谢起到防治AS的作用。本文就miR-33调控AS的相关靶点及中药调控miR-33防治AS的研究进行分析，为进一步研究miR-33提供理论依据，也为AS的诊断和中药治疗寻找新的靶点。

1 miR-33调控AS的作用机制

1.1 miR-33与炎症

炎症反应的激活在AS的启动和进展中起着核心作用，炎症细胞的积累导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)和细胞因子的产生，并促进AS发生发展[5]。核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)信号通路是介导炎症反应的常见通路，通过诱导miR-33激活NF-κB途径上调肿瘤坏死因子(tumor Necrosis Factor, TNF)α和白介素(interleukin, IL)6的表达，增加炎症反应[6]。除此之外，miR-33通过靶向于核受体相互作用蛋白(nuclear receptor interacting protein, NRIP)1的3'UTR来抑制NRIP1信号通路的活化，从而负性调控THP-1巨噬细胞的炎症应答[7]。AS斑块中的巨噬细胞分为促炎巨噬细胞(M1型)和抗炎巨噬细胞(M2型)，巨噬细胞极化为M2型是AS斑块消退的关键特征，抑制miR-33可以促进巨噬细胞从M1型向M2型转化，延缓动脉内壁纤维化和减少炎症的发生，从而减轻AS斑块的负担[8]。在miR-33介导的M2极化的过程中，需要腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)的激活[9]，并下调转录因子肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物(musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog, Maf)B的表达[10]。由此推测，抑制miR-33减少炎症因子的表达并促进巨噬细胞的M2极化，可能是AS的潜在防治方法。

1.2 miR-33与自噬

巨噬细胞的自噬会导致胆固醇代谢受损和不良的胞葬等多种病理过程。在自噬过程中，蓄积在细胞质中的脂滴被双层膜结构包裹形成自噬小体后，与溶酶体结合并被溶酶体中的酸性水解酶水解，形成游离胆固醇，在跨膜蛋白的介导下从细胞质流出至细胞外，随血液循环回到肝脏进行代谢，参与胆固醇逆转运[11]。自噬关键效应因子，如自噬基因相关蛋白(autophagy-related protein, ATG)5/12、溶酶体相关膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein, LAMP)1、微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)及AMPK信号通路依赖的转录因子叉头盒蛋白O3(forkhead box O3, FOXO3)、转录因子EB(transcription factor EB, TFEB)共同调节自噬反应，沉默miR-33启动以上自噬调节因子，促进自噬通量，从而增强脂质分解代谢和促进凋亡细胞清除以减少斑块坏死[12，13]。胆固醇流出实验表明，miR-33靶向人沉默调节蛋白(sirtuin, SIRT)6通过诱导巨噬细胞自噬促进细胞内胆固醇水解和流出，减少巨噬泡沫细胞的形成，进而减少AS斑块损伤面积[14]。因此，miR-33通过靶向自噬基因调节胆固醇稳态和控制炎症反应，是延缓AS发生发展的重要途径之一。

1.3 miR-33与线粒体功能

线粒体的主要功能是提供能量。目前研究证明，线粒体功能障碍会加重机体炎症反应及胆固醇蓄积的病理过程，加速AS病变的进程。线粒体功能障碍激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NOD-like receptor protein, NLRP)3炎性小体，释放活性IL-1β，血液单核细胞被招募到炎症血管壁，发展成M1型巨噬细胞[15]。同时线粒体功能障碍也会导致巨噬细胞内胆固醇的积累，减少细胞胆固醇流出[16]。在维持线粒体功能中，8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNA glycosylase, OGG)1修复线粒体的氧化应激损伤；过氧化物酶体增殖物激活型受体(peroxisome proliferation-activated receptors, PPARs)调节线粒体氧化代谢；过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子(peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator, PGC)1α和线粒体膜溶质运载蛋白家族25中第25号成员(solute carrier family 25 member 25, SLC25A25)参与线粒体生物合成；丙酮酸脱氢酶激酶同工酶(Pyruvate dehydrogenase kinase isoenzyme, PDK)4负责线粒体呼吸；核呼吸因子(nuclear respiratory factor, Nrf)1和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)对线粒体DNA的复制、转录和蛋白合成均发挥重要的调控作用[17，18，19]。抑制miR-33后可增加以上述基因的表达，促进巨噬细胞线粒体功能恢复，同时增强巨噬细胞胆固醇流出和改善巨噬细胞炎症反应[20，21]。此外，线粒体功能障碍会增加线粒体源性ROS、细胞色素C(cytochrome C, CytC)和凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)的释放，导致冠状动脉内皮细胞的线粒体氧化应激损伤和凋亡。miR-33可通过线粒体功能靶点改善脂质代谢紊乱和炎症反应，然而miR-33对细胞氧化应激和凋亡的调控作用尚未明确，需要进一步研究完善miR-33在线粒体功能中的重要作用。

1.4 miR-33与脂质代谢

脂质代谢紊乱是AS的主要危险因素之一，脂质代谢发生紊乱时，脂质聚积在动脉内壁上进而形成斑块，并对斑块的稳定性和血管腔狭窄造成影响[22]。大量研究表明，参与调节脂质代谢的miRNAs中，miR-33被认为是最重要的miRNAs之一，因为miR-33能够调节多种关键功能，包括胆固醇的合成、转运和摄取、脂肪酸降解以及胆汁酸的合成与分泌。

细胞内胆固醇转运对于维持细胞内胆固醇稳态至关重要。在多种靶点的调控下，将胆固醇运送到胆固醇合成、酯化、摄取和流出的适当位置。单核巨噬细胞表面存在3种胆固醇转运蛋白质，即三磷酸腺甘结合转运子(adenosine triphosphate-binding cassette, ABC)A1、G1及B类I型清道夫受体(scavenger receptor BI, SR-BI)[23]，通过抑制miR-33可调节ABCA1、ABCG1和SR-BI的表达，改善AS的胆固醇转运[24]。C型1类尼曼-匹克蛋白(niemann-pick C1 protein, NPC1)是晚期核内体和溶酶体中胆固醇转运的两个重要调节因子，是胆固醇流出和脂肪酸代谢的关键酶，miR-33直接靶向并抑制NPC1的表达[25]。敲除羟甾醇结合蛋白相关蛋白(oxysterol-binding protein-related protein, OSBPL)6可导致核内体异常聚集，促进细胞中游离胆固醇的积累，导致内质网胆固醇酯化减少。miRNA靶标预测发现，在OSBPL6中识别出miR-33结合位点，并在体内和体外实验中得到验证[26]。与此同时，NF-κB信号通路被发现不仅介导AS进程中的炎症反应，还可以通过NF-κB/miR-33a途径上调THP-1巨噬细胞ABCA1表达，促进胆固醇流出，可缓解胞内脂质蓄积[27]。

脂肪酸氧化水平降低和脂肪酸合成水平提高，会导致细胞脂质蓄积，形成高甘油三酯引发AS。抑制miR-33能够增加参与编码脂肪酸氧化的关键酶的表达，如肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT1A)、肉碱氧位甲基转移酶(carnitine O-Octanoyltransferase, CROT)、羟酰基辅酶a脱氢酶三功能多酶复合体亚基β(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional multienzyme complex subunit beta, HADHB)、蛋白激酶AMP活化催化亚基α1(protein kinase AMP activatedα1, PRKAA1)，同时可减少参与脂肪酸合成的关键酶的表达，如甾醇调控元件结合转录因子(sterol regulatory element-binding transcription factor, SREBF)1、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)、三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶(adenosine triphosphate citrate lyase, ACLY)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase, ACACA)，明显抑制血浆超低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)和甘油三酸酯(triglyceride, TG)水平，减少脂质在血管内皮的沉积，降低AS发生发展的几率[28]。

除此以外，胆汁酸合成和分泌等对调节脂质代谢有一定的调节作用。胆汁酸合成、分泌及排泄障碍，体内胆汁酸不足影响脂类物质的吸收和代谢，使大量胆固醇在体内积聚。在miR-33的沉默后，胆汁酸分泌的关键酶ABCB11、腺苷三磷酸酶酶I类8B成员1(ATPase class I type 8b member 1, ATP8B1)和胆汁酸合成的关键酶胆固醇7α羟化酶(cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1, CYP7A1)的表达明显上调，促进胆汁酸的合成与分泌，加速脂质的体内代谢[29，30]。以上结果说明，miR-33通过胆固醇的流转和摄取、脂肪酸降解以及胆汁酸的合成与分泌调节脂质代谢，通过靶向miR-33调控脂质代谢在AS的进程中起到重大作用。

笔者对上述miR-33调节AS的相关靶基因进行总结，并利用STRING数据库和Cytoscape软件构建miR-33靶基因的蛋白间互作(protein-protein interaction, PPI)网络图(图1)，综合得分>0.4的交互作用具有统计学意义。STRING[31]在线数据库，分析蛋白质之间的功能相互作用，可提供对疾病发生和发展机制的见解。Cytoscape(版本3.8.2)[32]是一个开放源码的生物信息学软件平台，用于可视化分子相互作用网络。

2 中药调节miR-33在防治AS中的作用机制

目前，AS的临床治疗主要采用降脂类及抗血小板类药物，该治疗方案作用靶点单一，会不可避免地阻断正常生理运行所需物质的合成，造成肝肾功能损害。而miR-33通过调控AS进程中的多靶点发挥疗效作用，与中医整体观念与辨证论治相契合，具有多靶点、多环节和双向性的特征。因此，深入研究中医药对miR-33的调控，将会为克服AS做出重大贡献。

根据中医证候分析，AS属于“血浊”“瘀血”“痰浊”等范畴，临床主要以活血化瘀通脉、健脾补气、祛痰降浊、清热解毒等为主要治则。近年来国内外大量研究发现，不论是中药复方汤剂还是中药单体，都可通过miR-33及miR-33的靶向基因，有效抑制AS的发生发展进程。在中药复方研究方面，通过细胞和动物模型实验发现，张立的健脾祛痰化瘀自拟方[33]、刘仕利的通脉降浊煎剂[34]、秦合伟的血管软化丸[35]、梁健的清脂通脉颗粒[36]均能抑制miR-33表达，同时还可影响SREBPs信号途径及下游通路ABCG1、ABCA1、NPC1基因及蛋白表达，从而提高胆固醇的流出率，降低泡沫细胞内胆固醇的含量。

中药复方成分复杂，在现代技术的基础上提取出中药单体，即复方中的有效成分。临床治疗心血管疾病的常见药物有血脂康、冠心康胶囊等，血脂康、冠心康分别由红曲、丹参单药制成。在临床试验中，Cao[37]等发现血脂康治疗提高了患者血浆miR-33水平，同时增加细胞胆固醇输出，减少AS的发生。丹参酮ⅡA是丹参酮中含量最丰富的生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、保护心脑血管等多种药理活性作用。Yang C[38]等证实，丹参酮ⅡA可以通过下调THP-1巨噬细胞中miR-33的表达，抑制促炎细胞因子的分泌，发挥对AS的保护作用。除此以外，黄芪甲苷[39]、黄芪总黄酮[40]、枸杞多糖[41]、儿茶素[42]、荷叶生物碱[43]等通过减少miR-33的生成，调控ABCA1和NF-κB表达，促进细胞胆固醇流出和抑制炎症反应以改善AS。

miR-33在炎症和脂质代谢方面的常用靶点ABCA1、ABCG1、NPC1、NF-κB等已经在中医药的研究中得到广泛证实，但还有许多与炎症和脂质代谢相关靶点的作用机制尚需进一步验证，如OSBPL6、CROT、CPT1A、HADHB、CYP7A1等。同时自噬与线粒体功能障碍也受miR-33的调控，并在AS的发生发展中起到重要作用，而中医药在自噬与线粒体功能障碍等方面的研究还未展开。因此，在miR-33的网络调控中，这些都是尚未研究的调控靶点，中医药能否通过控制miR-33及下游靶点，发挥防治AS的作用，需要进一步的明确。

3 展望

综上所述，miR-33在AS的炎症反应、自噬、线粒体功能障碍和脂质代谢等方面起到重要的调节作用。miR-33具有在血液中稳定存在并可被检测的特点，同时miR-33通过多个下游靶点形成网络调控机制，提示其具有作为AS诊断性生物标志物和治疗作用靶点的潜力。至今为止，AS的致病率、致残率和病死率虽然有所下降，但仍然是导致血管疾病的主要病因。西药通常使用的降脂药和降血小板药，虽对疾病有较高的治愈率，但存在胃肠道反应、肝肾功能损伤及影响其他正常生理功能等毒副作用，且西药作用靶点单一，容易产生耐药性。中药是由天然物质为基础转变而来的，对人体伤害性较小，作用于人体也具有多靶点、多环节、双向性的特征。现如今，从中医药处方中已挖掘出一部分中药单体或复方，并在临床与实验研究过程中被验证，中药可通过miR-33调节炎症、脂质代谢等方面，对AS有明显的疗效。因此，进行科学的实验深入研究中医药对miR-33的多靶点调控机制，可以挖掘出更多治疗AS的中药单体或复方，并且为中医药防治AS提供坚实的理论依据。