饲料中复方中草药对大菱鲆生长、饲料利用及非特异性免疫的影响

高学政 张配瑜 史雪莹 贲玲芝 郭晴晴 刘海燕

(河北师范大学生命科学学院， 石家庄 050024)

大菱鲆(Scophthalmus maximusLinnaeus)又名多宝鱼， 属鲽形目、菱鲆科、菱鲆属， 是我国北方重要的工厂化海水养殖鱼类。近年来随着高密度集约化养殖模式的发展， 各种养殖环境胁迫导致鱼体免疫力降低[1]， 大菱鲆养殖过程中如肠炎及腹水病等疾病频发， 进而带来药物使用问题， 2006年及2015年的2次大菱鲆药物残留事件也使得大菱鲆养殖业遭受重创。因此， 亟需开发水产绿色饲料免疫增强剂以提高大菱鲆的免疫力。

中草药富含多糖、脂肪、维生素和微量元素等多种动物机体所需要的营养成分， 及生物碱、皂苷、挥发油和色素等生物活性物质[2]， 兼具营养与药效的双重作用， 具有无毒、无污染、无抗药性、无残留且经济易得等优点， 能够增强鱼类的抗氧化与免疫力， 并通过提高摄食及改善肠道消化功能而促进鱼类生长[3，4]。复方中草药经合理配伍， 不同的活性成分能够表现出特定的协同效应， 比单一中草药更有效[5]。目前关于饲料中添加复方中草药对大菱鲆影响的研究报道较少， 且中草药配方和添加方式各异效果也有差别[6—9]。“四君子汤”是人参、白术、茯苓和甘草四味基本中草药为主的古方剂，其具有健脾益气、治疗胃肠功能紊乱和改善肠道黏膜免疫功能的药理作用[10]。采用高效液相色谱/串联质谱法分析“四君子汤”的主要活性化学成分为人参皂甙(来自人参)、黄酮类和三萜化合物(来自甘草)[11]。本研究在传统方剂“四君子汤”的基础上， 筛选了9种中草药进行配伍， 旨在探讨这种复方中草药的不同剂量对大菱鲆幼鱼生长性能、饲料利用及相关免疫指标的影响， 为复方中草药在大菱鲆养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计与实验饲料

本研究以9种中草药原材料配伍成复方中草药添加剂， 以水煎剂的形式在基础饲料中添加质量分数分别为0、1%、2%和4%的复方中草药制成4种试验饲料(对照组、1%组、2%组和4%组)。实验所用中草药购于河北省石家庄市康仁堂大药房。复方中草药由党参(Codonopsis pilosulaNannf.)、白术(Atractylodes macrocephalaKoidz.)、茯苓(Poria cocosWolf.)、熟地黄(Rehmannia glutinosaLibosch.)、甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)、山楂(Crataegus pinnatifidaBunge.)、五倍子(Rhus chinensisMill.)、栀子(Gardenia jasminoidesEllis.)和生姜(Zingiber officinaleRoscoe.)9种中草药组成， 配比为6∶5∶3∶3∶2∶2∶1∶1∶1。各中草药原材料经粉碎过40目筛， 按照方剂配伍置于不锈钢锅中逐级混匀， 加蒸馏水常温浸泡30min， 煮沸50min， 将药汁过滤倒出， 得到复方中草药的水煎剂， 使5 mL药液相当于1 g中草药。基础饲料以白鱼粉和鸡肉粉为主要蛋白源、α-淀粉为主要糖源配制而成， 饲料中蛋白质水平与脂肪水平的设定参考Li等[12]和彭墨[13]的结果， 基础饲料配方及营养成分见表1。将中草药水煎剂以质量分数分别为0、1%、2%和4%的比例添加到基础饲料中形成4种试验饲料， 混合均匀后制成直径为3.0 mm的软颗粒饲料， 存放于-20℃的冰箱中备用。

表1 基础饲料配方及营养组成Tab. 1 Formulation and proximate composition of the control diet

1.2 实验用鱼与养殖管理

实验用大菱鲆购自天津盛亿水产有限公司。正式实验开始前进行14d驯化， 使大菱鲆幼鱼能适应实验养殖环境。驯化期间每天2次(8:00和18:00)饱食投喂基础饲料。在驯化结束后， 禁食24h称重并随机分组。1140尾大小均匀， 体质健康的大菱鲆幼鱼[(22.01±0.01) g]随机放入12个长方体玻璃纤维缸(长2 m、宽1.2 m和高1 m)， 每组3个重复， 每个重复95尾。

养殖用水为沙滤后的自然海水， 每日换水2次，每次换水1/2。光照采用自然光照加人工光照， 光周期为14L∶10D。每天8:00和18:00进行饱食投喂。投喂30min后收集残饵并烘干称重， 以校正摄食量。试验期间保证溶氧充足， 水质条件如下: 溶氧大于6.0 mg/L， 盐度25‰—28‰， 水温15—18℃，氨氮浓度小于0.05 mg/L。正式养殖实验期为40d。

1.3 样品采集及测定

样品采集在养殖试验结束后， 对大菱鲆禁食24h， 称量并记录各缸中大菱鲆的总尾数和总体重。每缸随机选取5尾鱼， 称重并测量体长， 装入密封袋中于-20℃冰箱中保存， 用于进行鱼体营养组成的分析。每缸随机取5尾鱼进行解剖， 取出完整内脏团称重并记录， 然后从内脏团中剥离肝脏、脾脏并称重以计算脏体比、肝体比和脾指数等指标。另外每缸再随机取5尾鱼， 用经肝素钠润洗过的注射器尾静脉取血， 3000×g离心15min， 获得血浆用于非特异性免疫指标测定。

样品分析饲料与鱼体营养组成: 饲料与鱼体水分采用105℃直接干燥法(GB/T6435)测定。粗蛋白采用Foss全自动凯氏定氮仪Kjeltec8420测定。粗脂肪采用索氏提取法(GB/T6433)测定。粗灰分采用马弗炉灼烧法(GB/T6438)测定。能量采用Parr6200全自动氧弹热量仪测定。

非特异性免疫指标: 采用比浊法测定血浆溶菌酶(LZM)的活力; 利用免疫比浊法测定血浆免疫球蛋白(IgM)和补体C3的含量。以上指标均采用自南京建成生物技术研究所提供试剂盒。

指标计算增重率(WGR， %)=100 ×(终末体重-初始体重)/终末体重

特定生长率(SGR， %/d)=100×(ln终末体重-ln初始体重)/d

摄食率(FR， %/d)=100×摄食量/ [t×(终末体重+初始体重)/2]

饲料系数(FCR)=摄食量/(终末体重-初始体重)

存活率(SR， %)=100×终末鱼尾数/初始鱼尾数

肥满度(CF， g/cm3)=100×体重/体长3

脏体比(VSI)=100×内脏团重/体重

肝体比(HSI)=100×肝脏重/体重

脾指数(SI)=100×脾脏重/体重

1.4 数据分析

实验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示， 采用Statistica10.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)， 若差异显著时进行Duncan’s多重比较， 显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 复方中草药对大菱鲆生长与饲料利用的影响

复方中草药对大菱鲆幼鱼的摄食率无显著影响(P≥0.05)， 但显著影响了大菱鲆的终末体重、增重率、特定生长率和饲料系数(P＜0.05)。1%组大菱鲆幼鱼终末均重、增重率、特定生长率显著高于其他各组(P＜0.05)， 而4%组的生长显著低于其他各组(P＜0.05)。1%组的饲料系数显著低于其他各组(P＜0.05)， 其他各组间无显著差异(P≥0.05; 表2)。

表2 复方中草药对大菱鲆生长与饲料利用的影响Tab. 2 The effect of Chinese herbal medicine on growth and feed utilization of turbot

2.2 复方中草药对大菱鲆形体指标的影响

结果表明复方中草药对脏体比及肝体比没有显著影响， 但显著影响了大菱鲆的肥满度与脾指数，随着添加水平的升高， 呈现出先升高后降低的趋势(表3)。1%组大菱鲆幼鱼肥满度显著高于对照组和4%组(P＜0.05)， 1%组的脾指数显著高于其他各组(P＜0.05)， 其余各组之间均无显著差异(P≥0.05)。

表3 复方中草药对大菱鲆形体指标的影响Tab. 3 The effect of Chinese herbal medicine on physical indicators of turbot

2.3 复方中草药对大菱鲆鱼体营养组成的影响

由表4可知， 复方中草药对大菱鲆幼鱼的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和能量均无显著影响(P≥0.05)。

表4 复方中草药对大菱鲆鱼体营养组成的影响Tab. 4 The effect of Chinese herbal medicine on body composition of turbot

2.4 复方中草药对大菱鲆非特异性免疫指标的影响

由表5可见， 复方中草药显著影响了大菱鲆幼鱼血浆中补体C3和LZM的含量(P＜0.05)， 但对IgM含量没有显著影响(P≥0.05)。1%组大菱鲆幼鱼血浆中补体C3和LZM含量显著高于对照组(P＜0.05); 2%组大菱鲆幼鱼血浆中LZM含量显著高于对照组(P＜0.05)， 而补体C3含量与对照组无显著性差异(P≥0.05)。

3 讨论

3.1 复方中草药对大菱鲆摄食生长与饲料利用的影响

本研究所采用9种中草药活性成分物质包括多糖类、黄酮类、萜类化合物(单萜类、三萜类、倍半萜烯类、环烯醚萜)及各中草药特有的活性化学成分(党参-聚乙炔、多烯; 甘草-甘草甜素; 五倍子-没食子酸， 生姜-姜辣素、姜酮酚， 栀子-藏红花素)[15—23]。在本实验条件下， 添加1%的复方中草药可显著提高大菱鲆的生长性能和饲料利用， 且此复方中草药对摄食率无显著影响， 因此， 本实验复方中草药可能是通过其所富含的多种营养成分来增强机体新陈代谢， 促进蛋白质合成来提高鱼体饲料利用能力， 从而达到促进生长性能的作用。前人研究表明中草药活性成分可提高鱼体消化酶活性[24]、调节肠道微生物[25]; 中草药多酚类、黄酮类、多糖类和萜类化合物可提高鱼体抗氧化能力和抗病力，从而间接促进鱼体生长[26]; 另外， 中草药有效成分可促进DNA、RNA和蛋白质合成及刺激生长激素-胰岛素样生长因子轴1(GH-IGF-1轴)[27，28]。在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的研究中， 饲料中添加0.05%—0.30%的党参多糖可显著促进其生长和饲料利用[29]。同样， 在大头亮鲃(Luciobarbus capito)的饲料中添加0.1%—0.4%熟地黄多糖显著提高特定生长率和降低饲料系数[28]。使用0.8%—1.0%的干姜来饲喂南亚野鲮(Labeo rohita)幼鱼60d， 可显著提高特定生长率[30]。在水产动物中使用复方中草药也可发现类似现象。由白术、茯苓和甘草等组成的复方中草药也提高了大菱鲆的增重率， 且降低了饲料系数[9]。另外， 陈辉辉等[31]在饲料中添加甘草、山楂和茯苓等11味中草药饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)， 降低了饲料系数， 提高了特定生长率和增重率。在花鲈(Lateolabrax japonicus)的研究中， 饲喂含有 2%复方中草药的特定生长率和增重率却显著低于0.8%组[24]， 这与本实验结果相一致， 本实验中高剂量复方中草药会导致特定生长率下降可能是由于中草药导致大菱鲆过度免疫反应， 从而消耗了更多的能量。

表 5 复方中草药对大菱鲆非特异性免疫指标的影响Tab. 5 The effect of Chinese herbal medicine on nonspecific immune indicators of turbot

复方中草药的配方与添加形式会对中草药的药效发挥和适宜添加量产生影响[32]。单味药或单一活性成分存在作用不全面的缺点， 复合方剂也不应是2种以上中草药的简单叠加， 传统方剂中某些固定配伍性的中草药可能并不适用于水生动物， 制约着中草药作为鱼类饲料添加剂的发展。本实验所用方剂是通过已知渔用中草药的显著疗效与中药学“君臣辅使”理论的结合， 适当加减药剂药量进行的合理配伍， 以达到促进生长发育和提高免疫的目的。本实验添加1%的复方中草药显著提高了大菱鲆的肥满度， 2%组和4%组鱼的肥满度也有所提高， 这与中草药促进鲤、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的肥满度升高的结果一致[33，34]， 肥满度与鱼类的营养状况直接相关[35]， 也进一步说明本实验中1%的复方中草药对大菱鲆的机体生理和营养状况产生了良好效果。

3.2 复方中草药对大菱鲆非特异性免疫的影响

非特异性免疫系统是鱼类抵御病原侵袭的第一道防线。中草药及其提取物含有多糖、黄酮类、皂苷、挥发油、多酚类、生物碱、萜类、凝集素和多种氨基酸等活性成分， 能够刺激补体和溶菌酶等的活性和抗体反应， 促进吞噬细胞的功能，提高杀菌活性， 来对抗由细菌、真菌、病毒和寄生虫等引起疾病[36]。以前研究发现， 党参对大黄鱼(Larimichthys croceaRichardson.)[37]、鲫[38]和仿刺参(Apostichopus japonicus)[39]， 含白术和山楂的复方对黄鳝(Monopterus albus)[40]， 茯苓对施氏鲟(Acipenser schrenckiBrandt.)[41]， 熟地黄和甘草对鲤[42，43]，五倍子对鳙(Aristichthys nobilis)[44]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[45]， 栀子对克氏原螯虾(Procambarus clarkiaGirard.)[46]， 生姜对尖吻鲈(Lates calcariferBloch.)[47]和斑马鱼(Danio rerio)[48]等均显示出提高免疫功能和增强抗炎抗菌能力的作用。复方中草药经合理配伍， 不同的活性成分能够表现出特定的协同效应， 可能比单一草药更有效[5]。本研究中的复方采用了具有健脾益气、清热解毒、收湿敛疮和抗炎杀菌等功效的中草药， 结果表明其可显著提高大菱鲆的补体C3和溶菌酶活性， 这也与李华等[7]和路晶晶等[9]的结果相似， 能够提高大菱鲆免疫功能。

脾脏作为鱼体内重要的免疫器官， 其增殖和发育与鱼类的免疫功能密切相关[49]。在草鱼、罗非鱼和黄颡鱼的研究中发现， 中草药可显著促进脾指数升高， 增强免疫力[50—52]。在本实验中1%组大菱鲆的脾指数显著提高， 另两组也较对照组略有提高，说明本实验中的复方中草药有利于大菱鲆的脾脏发育， 具有一定的免疫调节作用。

以前研究结果表明免疫增强剂对鱼类免疫力的作用受给药时间与添加剂量的综合影响， 添加剂量与免疫增强作用之间并非总呈正相关[53，54]。罗非鱼的研究发现在饲料中添加0.025%—0.2%剂量的苦参(Sophora flavescensAit.)提取物时， 罗非鱼的非特异性免疫指标在0.1%时的增强作用最大[55]。本试验也表现出相似的结果， 添加2%和4%的高浓度组的免疫指标均低于1%组， 说明过高浓度的复方中草药对鱼类的免疫功能反而有一定的抑制作用。此外， 在对凡纳滨对虾连续投喂复方中草药21d后发现， 其消化酶指标及抗氧化指标分别在7d和14d达到最高值， 表明复方中草药的作用与投喂时间长短也有着直接联系[56]。然而， 本研究仅在40d时分析了免疫指标， 是否还存在更好的投喂时间和方式还需进一步探讨。

4 结论

本研究中的复方中草药合煎剂在饲喂大菱鲆40d后显著提高了大菱鲆的特定生长率， 降低了饲料系数， 显著提高了肥满度和脾指数， 并通过提高大菱鲆血浆补体C3含量和溶菌酶活力增强了大菱鲆的非特异性免疫力。综合分析， 本复方中草药在大菱鲆配合饲料中的推荐添加量为1%。