神经毒素BMAA在淡水池塘水体中的健康风险及调控技术

顾笑笑 吴 湘 张 爱 俞程强 杨林浩 孙 怡 李珍珍

(湖州师范学院生命科学学院， 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室， 湖州 313000)

β-N-甲氨基-L-丙氨酸(β-N-methylamino-Lalanine， BMAA)是一种由蓝藻产生的具有慢性神经毒性的藻毒素， 被认为是诱导肌萎缩侧索硬化-帕金森痴呆综合征(ALS-PDS)的重要环境因子[1]。Purdie等[2]通过对斑马鱼的体外实验推测BMAA可以形成一种类似谷氨酸酯的物质而促使神经元退化， 诱发神经发育系统或者神经肌肉的异常。BMAA毒素具有生物累积和生物放大效应[1，3—8]， 在深受蓝藻水华污染的淡水养殖生态系统中生长的养殖产品也极易吸收、富集和放大BMAA毒素而最终进入人体。我国作为世界第一水产养殖大国， 关注和调查淡水养殖生态系统中BMAA毒素的污染水平及在水产品中的富集效应， 并对其进行健康风险评估已显得尤为迫切和亟需。

此外， 如何安全、高效、经济地调控藻毒素的污染问题一直是学者研究的热点和重点。近年来，以水生植物化感物质[9—12]和缓释颗粒技术[13—16]为基础制备的化感缓释抑藻剂对产毒蓝藻进行生长抑制， 从而有效控制藻毒素产生与释放为解决藻毒素污染问题提供了新思路与新方法。本文重点针对BMAA毒素在环境中降解缓慢等特点， 开发以没食子酸为化感物质、氧化石墨烯为控释载体的新型化感缓释抑藻剂用于抑制产毒蓝藻生长和调控BMAA毒素污染， 研究结果将对保障我国淡水养殖产业的安全生产和人类健康具有重要的意义。

综上所述， 本文拟通过调查和检测BMAA毒素在我国长江中下游地区典型淡水养殖生态系统的养殖水体、底泥及6种常见淡水养殖产品(河蚬Corbiculafluminea、铜锈环棱螺Bellamya aeruginosa、日本沼虾Macrobrachium nipponense、中华绒螯蟹Eriocheirsinensis、青鱼Mylopharyngodon piceus和鲫Carassius auratus)中的污染水平， 开展BMAA毒素对人体的健康风险评估， 并在此基础上初步提出基于我国国情的淡水养殖产品质量安全的BMAA毒素建议标准限值(GV); 同时针对新型化感缓释抑藻剂的制备、调控BMAA毒素污染的效果及其生态安全性评价等方面逐一开展研究， 为其今后高效、安全地应用于蓝藻水华频发的淡水养殖池塘藻毒素污染治理提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集、处理与检测

水体、底泥及生物样品的采集与处理本实验于2019年7—9月在湖州市淡水养殖区域随机选取3类蓝藻水华暴发严重的淡水混合养殖池塘(河蚬+鲫混养、日本沼虾+中华绒螯蟹混养、青鱼+铜锈环棱螺混养)作为BMAA调查采样的研究对象， 上述每种混养池塘数量均设置为3个， 分别采集其养殖水体、底泥及养殖生物样品(图1)。每个池塘设置4个采样点， 分别取其深层水及浅层水均匀混合得到养殖水体样品; 采泥3次后均匀混合得到底泥样品。水样过500目不锈钢筛后经0.45 μm醋酸纤维滤膜减压抽滤2次， 于-20℃冻存; 底泥去除杂物， 冷冻干燥处理后置于研钵中研碎， 于-20℃冻存; 同时在对应的单个养殖池塘中随机获取河蚬10只(体长6—9 mm)、铜锈环棱螺10只(壳高15—22 mm)、日本沼虾20只(体长5—6 cm)、中华绒螯蟹5只(体重100—150 g)、青鱼3尾(体长75—85 cm)和鲫10尾(体重180—200 g)， 冷藏保存并带回实验室解剖， 取肌肉组织粉碎匀浆， 于-80℃保存。

图1 采样点位示意图Fig. 1 Schematic diagram of sampling points

样品中BMAA含量的测定取水样经Waters Oasis MCX 混合型阳离子交换反向吸附柱处理(活化: 2 mL甲醇， 调整: 2 mL超纯水， 上样: 1.5 mL水样， 淋洗1: 2 mL 2%甲酸， 淋洗2: 2 mL甲醇， 洗脱:2.5 mL 5%氨化甲醇)并收集洗脱液[8]。底泥及生物样品分别取15 mg， 加入2 mL预冷的0.1 mol/L TCA，反复冻融并超声波破碎后离心， 合并上清液[1]; 沉淀中加入2 mL 6 mol/L HCl于110℃水解24h后， 收集水解液。将上述各提取液氮吹至近干后， 使用Waters AccQ Tag化学试剂包进行衍生化处理[1，17]， 后经Agilent 1290/6460 HPLC-MS/MS检测各样品中BMAA的浓度水平。

BMAA毒素建议安全标准限值的确定及对人体的健康风险评估参照美国国家科学院提出的健康风险评价方法[18]， 开展BMAA毒素对人体的健康风险评估。参考Spencer等[19]的猕猴急性毒性实验数据， 确定BMAA不致引起有害健康效应最高剂量NOAEL值， 并根据公式(1-1)推算出BMAA毒素人类每日容许摄入量TDI值， 根据公式(1-2)计算养殖水产品BMAA毒素的估计每日摄入量EDI值， 根据公式(1-3)确定淡水养殖产品BMAA毒素建议安全标准限值GV; 通过EDI与TDI、BMAA浓度与GV值的比较， 评估淡水养殖产品中的BMAA毒素对人体健康存在的潜在风险。

式中，NOAEL取值100 mg/(kg·d);UF是不确定系数，取值1000;BW是国际人体身体平均质量， 取值60 kg(成人)或20 kg(儿童);AF是分配系数， 取值0.2;C是水产品体内总BMAA浓度， 单位为μg/g干重;A是日常暴露量， 取值100 g干重/d。

1.2 新型化感缓释抑藻剂的制备及其调控BMAA污染的效果研究

新型化感缓释抑藻剂的制备称取适量氧化石墨烯(GO， 图2a)溶于水， 超声波震荡混合均匀后依次加入1.2 g氢氧化钠和0.8 g氯乙酸， 并用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液活化GO 1h。向上述混合液中加入适量L-半胱氨酸盐酸盐并孵育12h， 透析后冷冻干燥得到修饰后的氧化石墨烯(Cys-GO， 图2b)粉末[20]。称取适量没食子酸和Cys-GO粉末溶于水，用磁力搅拌器混合均匀后加入适量海藻酸钠并运用超声波辅助震荡制备分散液， 用注射器移取分散液滴入10% CaCl2溶液中固化成钙凝胶球后， 取出并用超纯水清洗3次， 于40℃烘箱内干燥得到新型化感缓释抑藻剂。

图2 GO(a)与Cys-GO(b)的扫描电镜图Fig. 2 Scanning electron microscopic images of GO (a) and Cys-GO (b)

新型化感缓释抑藻剂调控BMAA污染的效果研究供试藻种选用产毒蓝藻“铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa， FACHB-315)”， 购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库， 采用BG-11培养基扩大培养， 培养方法参考刘菲菲等[21]。根据前期开展的抑藻能力测试结果发现， 当没食子酸浓度为12.5 mg/L时制备的化感缓释抑藻剂具有较强的抑制产毒蓝藻生长的能力， 故后续的抑藻剂调控BMAA污染及其生态安全性评价均采用此浓度开展研究。通过比较分析上述化感缓释抑藻剂添加前后铜绿微囊藻培养液中胞内BMAA、胞外BMAA及BMAA总量的变化情况， 以此阐明抑藻剂对BMAA毒素污染的调控效果。具体步骤如下: 分别定量采集抑藻剂添加前后的受试藻液， 离心并冷冻干燥处理， 按照上述生物样品处理方法进行处理并检测各组胞内BMAA含量， 按上述水样处理方法处理并检测各组胞外BMAA含量， 同步测定藻细胞质量浓度(ρ)， 并按照公式(1-4)计算各组BMAA总含量。

式中，C1是单位质量细胞内BMAA含量， 单位为μg/g干重;ρ是培养液的藻细胞的质量浓度， 单位为g干重/mL;V是培养液体积， 单位为mL;C2是胞外BMAA的含量， 单位为μg/mL。

1.3 新型化感缓释抑藻剂的生态安全性评价

参考GB/T 16125-2012《大型溞急性毒性实验方法》[22]和GB/T 13267-1991《物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》[23]选育受试对象。以重铬酸钾为参考毒物测试大型溞和斑马鱼的敏感性， 分别设置新型化感缓释抑藻剂实验组及空白对照组，平行3次。实验连续观察48h， 记录受试生物活动或死亡情况， 计算存活率(%)并评价其生态安全性。

1.4 数据统计与分析

所有样品平行测定3次， 所得数据采用平均数±标准差(mean±SD)表示。利用Excel 2016和Origin 2018进行数据分析和绘图。用SPSS 25.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 淡水池塘养殖池塘中BMAA的污染水平

根据养殖池塘水体、底泥、养殖产品(河蚬、铜锈环棱螺、日本沼虾、中华绒螯蟹、青鱼、鲫)样本内BMAA含量的HPLC-MS/MS检测结果(图3)，初步阐明了BMAA在淡水养殖池塘中的污染分布情况及其含量水平(表1)。

图3 淡水池塘养殖池塘中水体、底泥以及6种水产品的BMAA色谱图Fig. 3 BMAA chromatogram of water， sediment and six kinds of aquaculture products in freshwater aquaculture ponds

结果表明， 本实验所选取的软体动物(河蚬、铜锈环棱螺)检测到的BMAA平均含量是甲壳动物(日本沼虾、中华绒螯蟹)含量的1.56倍， 是杂食性鱼类(青鱼、鲫)含量的1.85倍; 蓝藻暴发时期6种水产品中铜锈环棱螺体内的BMAA富集程度最高， 约为同时期河蚬体内BMAA含量的2倍。由此可知，BMAA毒素在本文所调查的淡水养殖环境和生物体内均有一定程度的污染， 且具有生物累积效应。

2.2 淡水养殖产品中BMAA的健康风险评估

TDI值 根据Spencer等[19]的猕猴急性毒性实验数据， 确定BMAA的不致引起有害健康效应最高剂量NOAEL值为100 mg/(kg·d)， 设置不确定系数(UF)为种间差异10， 种内差异10， 数据库限制10， 根据上文公式(1-1)可推算出BMAA毒素的TDI值为100 μg/(kg·d)。

EDI值根据样品中BMAA的含量及公式(1-2)， 可计算出6种淡水养殖产品BMAA的估计每日摄入量EDI值(表2)。通过考察成人和儿童两种情况均发现: 上述6种水产品中BMAA的EDI值均远小于TDI值(图3)。参照美国国家科学院提出的健康风险评价方法[18]， 若EDI值大于TDI值， 则认为被BMAA毒素污染的淡水养殖产品是不安全的， 反之则可认为安全。因此可以认为本实验所调查的6种淡水养殖产品虽已被BMAA毒素污染， 但目前尚处于安全水平。

表2 6种淡水养殖产品成人和儿童的EDI值Tab. 2 EDI values of six freshwater aquaculture products for adults and children

GV值根据公式(1-3)， 可计算出淡水养殖产品BMAA的建议安全标准限值(GV): 成人为12 μg/g、儿童为3 μg/g。结合表1中6种淡水养殖产品中BMAA的含量及图4中BMAA含量与GV值的关系图， 可以发现本文选取的6种淡水养殖产品中的BMAA含量均远低于成人和儿童BMAA的GV值。

图4 BMAA含量和EDI值(成人、儿童)、TDI值、GV值(成人、儿童)之间的关系图Fig. 4 The relationships between BMAA contents， EDI values(adults， children)， TDI values and GV values (adults， children)

表1 淡水池塘养殖池塘中BMAA的含量Tab. 1 Contents of BMAA in freshwater aquaculture ponds

2.3 新型化感缓释抑藻剂调控BMAA污染的效果

对12.5 mg/L新型化感缓释抑藻剂投放前后铜绿微囊藻受试藻液中的胞内、胞外BMAA含量及藻细胞质量浓度进行分析检测， 并计算BMAA总量(表3)。

表3 新型化感缓释抑藻剂添加前后铜绿微囊藻受试藻液中BMAA含量的变化Tab. 3 Changes of BMAA content in the algae solution of M.aeruginosa before and after adding new allelopathic sustainedrelease algae inhibitors

结果表明， 新型化感缓释抑藻剂投放前后受试藻液的胞外BMAA含量都非常低， 虽略有增加但是差异不显著(P＞0.05)， 由此可知， 抑藻剂的添加对铜绿微囊藻BMAA毒素的释放无显著影响; 抑藻剂添加7d后胞内BMAA含量出现显著下降， 而胞外BMAA增加不明显， BMAA总量下降69.72%。综上所述， 12.5 mg/L新型化感缓释抑藻剂对BMAA毒素污染具有较好的调控效果。

2.4 新型化感缓释抑藻剂的生态安全性评价

新型化感缓释抑藻剂的生物急性毒性测试结果表明， 新型化感缓释抑藻剂投放浓度为12.5 mg/L时， 大型溞的24h存活率仍可达70%， 斑马鱼的48h存活率达到80%。由此可知， 本文所研发的新型化感缓释抑藻剂在保证较好调控藻毒素污染效果的同时还具有良好的生态安全性。

3 讨论

3.1 淡水养殖池塘中BMAA的污染水平及其健康风险评估

据报道， BMAA毒素在水生动物中存在生物富集和生物放大等现象。Brand等[6]在调查佛罗里达州卡卢萨哈奇河中BMAA污染情况时发现， 贻贝(Mytilus edulis)、弓鳍鱼(Amia calva)、鳄雀鳝(Atractosteus spatula)、大嘴鲈(Largemouth bass)等水生生物中BMAA的累积浓度达到250—2559 μg/g FW; Mondo等[24]调查了南佛罗里达7种鲨鱼鱼翅中BMAA的富集情况， 结果发现其浓度介于144—1836 ng/mg FW。BMAA沿“蓝藻-苏铁-果蝠”这一食物链的传递过程中， 其浓度被放大了1万倍以上[3，4]; 在波罗的海区域生态系统中， 浮游动物体内BMAA含量比它们的食物-蓝藻平均增加6倍， 在一些鱼类的组织中， BMAA含量被放大200倍[25]。本实验研究结果表明， BMAA毒素在所调查的6种典型淡水养殖产品中的浓度介于0.363—1.040 μg/g FW， 远低于上述研究的BMAA污染水平， 这可能是由于人工养殖环境下的淡水养殖产品主要食物来源为饲料饵料等， 食物链结构相对比较简单， 从而养殖生物体内通过食物链途径积累和富集的BMAA毒素要远低于自然条件下生长的水生生物。

WHO等国际组织和多数国家均未对BMAA开展健康风险评估工作， 导致BMAA的相关限量标准缺失。根据Roney等[26]的研究推测， 中国居民接触到BMAA毒素最可能的途径是食用受BMAA污染的水产品， 但是我国目前尚未制定关于BMAA的淡水养殖产品质量安全的标准限值。本实验的研究结果表明， BMAA毒素在所调查的淡水养殖环境和生物体内均有一定程度的污染， 且具有生物累积效应。6种淡水养殖产品中BMAA的EDI值(估计每日摄入量)均远小于TDI值(每日容许摄入量)， 其浓度水平也远低于GV值(建议安全标准限值: 成人12 μg/g、儿童3 μg/g)， 对人体的健康风险较低。但是考虑到本研究中实验样品的采集区域有限， 需要在今后的工作中继续验证研究结果的准确和可靠性。

3.2 化感缓释抑藻剂对BMAA毒素污染的调控效果及其生态安全性

BMAA化学性质稳定， 不易分解， 并且国内外针对BMAA毒素去除技术的研究也鲜有报道。Esterhuizen等[27，28]采用沉积物物理吸附和大型水生植物吸收BMAA等方式降低水体中BMAA毒素的污染水平， 但是沉积物吸附的BMAA极易转移至底栖动物而被其他水生动物捕食， 受BMAA污染的大型水生植物也可被鱼类直接摄食， 故均不宜用于淡水养殖生态系统中BMAA毒素的去除。利用化感物质对产毒蓝藻生长进行抑制， 进而从源头上减少BMAA毒素的产生与释放可作为一种调控淡水养殖生态系统中BMAA毒素污染较为切实有效的方法。但是必须注意到， 在养殖水体中直接投放化感物质容易造成局部浓度过高而对其他水生生物产生不利影响， 同时抑藻的有效时间也大大缩短[29，30]。为此， 使用具有缓释功能的化感抑藻剂可避免上述弊端的发生。刘振宇和刘彬[31]的研究发现， 使用青蒿素和壳聚糖/海藻酸钠制成的缓释体胶囊的抑藻有效时间比纯青蒿素增加了54%; 黄皓旻[9]制备的黄酮仿生化感抑藻剂可持续释放化感物质的时间长达120d。本文研发的新型化感缓释抑藻剂能有效调控BMAA毒素污染， 添加12.5 mg/L抑藻剂7d后铜绿微囊藻的胞内BMAA含量显著下降， 胞外BMAA无明显增加， BMAA总量也随之明显减少。可见产毒蓝藻(铜绿微囊藻)在适当剂量的化感缓释抑藻剂的胁迫下其胞内BMAA毒素的合成受到了一定程度的抑制， 并且不会促进胞外BMAA毒素的释放， 从而有效降低BMAA毒素总量， 对BMAA污染具有良好的调控效果。

作为植物的次生代谢产物， 化感物质在投加过程中是否会对环境产生一定的副作用， 尤其是对水环境中其他水生生物的生态安全性也亟须研究明确。张庭廷等[32]研究发现， 一种名为“对羟基苯甲酸”的化感物质以最佳抑藻浓度0.8 mmol/L作用于鲤(Cyprinus carpio)后， 通过对鱼鳃、肌肉、肝脏及血液等多种生化指标分析证明， 对羟基苯甲酸在该浓度下对鲤无明显的毒性作用; 郑春艳等[33]研究了3种化感物质(亚油酸、水杨酸和对羟基苯甲酸)对多刺裸腹蚤(Moina macrocopa straus)的毒性作用，结果发现， 亚油酸对多刺裸腹蚤属于高毒， 水杨酸及对羟基苯甲酸属于低毒。本研究开发的新型化感缓释抑藻剂投放浓度为12.5 mg/L时， 未对大型溞和斑马鱼产生明显的毒性效应。由此可知， 本文所研发的新型化感缓释抑藻剂在保证较好抑藻效果的同时还具有良好的生态安全性， 可应用至实际淡水养殖池塘产毒蓝藻水华治理中。

4 结论

(1) BMAA毒素在本文所调查的淡水养殖环境和生物体内均有一定程度的污染， 具有生物累积效。(2)本文所调查的6种淡水养殖产品中BMAA的EDI值远低于TDI值， BMAA浓度水平也远低于成人与儿童的BMAA建议安全标准限值(GV)， 因此可认为其对人体的健康风险较小。(3)新型化感缓释抑藻剂在有效降低BMAA毒素污染水平的同时兼具良好的生态安全性， 可应用至实际养殖池塘产毒蓝藻及藻毒素污染的防治工作。