应用鳗鲡肾脏细胞分离疱疹病毒及毒株理化性质试验

李苗苗

（福建省水产技术推广总站，福建福州 350002）

鳗鲡养殖在我国养殖业中占有重要的地位，养殖品种以美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡和日本鳗鲡为主。鳗鲡具有较高的营养价值，是重要的经济鱼类之一，国内外市场需求量较大，出口前景广阔[1-3]；但随着鳗鲡养殖规模的扩大，鳗鲡病害的发生率和死亡率也在逐渐升高，严重制约了鳗鲡养殖产业的发展[4-5]。引起鳗鲡发生病害的病原有细菌、病毒、寄生虫等[6]，其中病毒性疾病对鳗鲡的危害最大[7]，目前已有多个国家和地区从病鳗上检测出了疱疹病毒[8-11]、圆环病毒[12-14]、弹状病毒[15-16]、双RNA病毒[17]、小核糖核酸病毒[18]等多种病毒[19-20]。其中，鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus，AnHV）感染对鳗鲡养殖产业造成了严重影响，主要引起鳗鲡出现“脱黏败血症”，即病鳗体表黏液分泌增多、脱落，烂鳃，丧失食欲，胸鳍、鳃盖和腹部充血发炎，鳃丝充血坏死，肝脏充血，肾脏肿胀等症状[21]。该病主要发生在苗种阶段，发病率达60%，死亡率达20%，严重时可达60%以上[22]。对该病目前尚未有有效的治疗方法，利用细胞系对病毒进行分离纯化并进行病毒理化特性研究，有助于病毒防控新技术的开发。

本研究首次应用鳗鲡肾脏细胞（European eel kidney cell，EEK）从出现典型“脱黏败血症”疑似病料中分离到一株AnHV，通过细胞培养、电镜观察、PCR 等方法对其进行鉴定，并开展了该病毒株的温度和酸碱度敏感性试验，以期为AnHV 感染的临床诊断和综合防控技术开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病鱼材料

从福建省某鳗鲡养殖场收集出现头部和腹部红肿、出血，体表黏液增多，肝脏肿大、失血发白，脾脏、肾脏肿大等典型“脱黏败血症”的疑似病料（图1），采集鳃、肝、肾、脾等组织，于-80 ℃保存。试验在福建省水产技术推广总站中心实验室，于2018 年4—12 月进行。

1.2 细胞培养

EEK 用DMEM/F12（1:1）培养液（含10%FBS），在27 ℃条件下培养，培养至细胞几乎铺满培养瓶底部时待用。

1.3 病毒分离

将患病鳗鲡组织加入少量PBS制备成匀浆液，用于AnHV PCR 鉴定和接种EEK 细胞。将1 份鳗鲡病料组织匀浆液按1:10 最终稀释度重悬于细胞培养液（含1 000 IU/mL 青霉素和1 000 μg/mL 链霉素）中，4 ℃孵育过夜；0.22 μm 滤膜过滤除菌后对滤液继续作2 次1:10 梯度稀释，将10-1、10-2、10-33 个稀释度的病鱼组织匀浆液接种至长满的EEK，于27 ℃条件下吸附1～2 h，补足细胞培养液后置于27 ℃培养，逐日观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）情况并做好记录，同时设正常细胞作为对照。

1.4 病毒粒子电镜观察

1.4.1 病毒粒子负染观察 收集病毒感染出现CPE 的EEK 上清液，12 000 r/min 离心40 min，取上清液于3 kD 超滤离心管中，7 000 r/min 离心40 min，弃滤液，加入等体积无菌超纯水重悬，7 000 r/min 离心40 min，收集膜前液。2%磷钨酸染色后置于电子显微镜下观察、拍照。

1.4.2 细胞超薄切片观察 将冻融后的病毒感染细胞悬液继续接种EEK，待细胞出现CPE 时（约第3 天）刮取细胞，收集细胞，加入2.5%戊二醛固定液，4 ℃条件下固定4～12 h。洗涤、脱水、包埋后制备细胞超薄切片，经醋酸铀、柠檬酸铅双染色，干燥后置于电子显微镜下观察、拍照。

1.5 病毒PCR 鉴定

提取鳗鲡病料组织DNA 和感染病毒的EEK培养物DNA，用AnHV DNA 聚合酶基因特异性引物（表1）进行PCR 扩增，并将PCR 扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得的序列通过NCBI blast 进行比对分析。

表1 AnHV PCR 检测引物序列

1.6 病毒滴度测定

将病毒悬液作连续10 倍稀释至10-10，将10-1～10-10梯度的病毒悬液接种至长满EEK 的96孔培养板，每孔接种100 μL，每个稀释度接种8孔，培养板的最后一列设置为细胞空白对照，置于27 ℃条件下吸附1～2 h，每孔补加培养液至200 μL，27 ℃培养，逐日观察CPE 并做好记录，根据Reed-Muench两氏法进行病毒滴度TCID50测定。

1.7 温度敏感性试验

将病毒悬液置于30、40、50、60 ℃条件下分别处理30 min 后接种EEK，同时设立细胞空白对照，按照病毒滴度测定方法计算其TCID50。

1.8 酸碱度敏感性试验

配制0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH，分别用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 将病毒悬液酸碱度调至pH3 和pH11，置于27 ℃处理30 min 后接种EEK，设立细胞空白对照，按照病毒滴度测定方法计算其TCID50。

2 结果与分析

2.1 病毒细胞分离

将病鳗组织匀浆液接种EEK，置于27 ℃培养，EEK 在接种10-1、10-2、10-33 个稀释度病毒组织悬液后第4 天均出现明显CPE（图2-A、B、C），主要表现为细胞收缩、变圆，细胞脱壁悬浮，逐渐裂解死亡，而对照组细胞正常生长（图2-D），表明EEK 对AnHV 敏感，可用于该病毒的分离。

2.2 病毒电镜观察

将病毒液浓缩，经磷钨酸负染色，干燥后在电镜下观察，可见直径近200 nm 的病毒颗粒（图3-A）。收集病毒感染出现CPE 的EEK，制作超薄切片，在电子显微镜下观察，可观察到细胞核内有大量六角形的病毒粒子（图3-B）。因典型的疱疹病毒大小为180～200 nm，二十面体结构，本试验中感染EEK 的病毒很可能为AnHV。

2.3 病毒PCR 鉴定

用AnHV DNA 聚合酶基因特异性引物对患病鳗鲡组织DNA 和感染病毒的EEK 培养物DNA进行PCR 扩增，获得特异性单一条带，大小约394 bp（图4）。测序后的序列比对分析结果（图5）显示，其与GenBank 所公布AnHV 毒株基因序列相似性均在99%以上，表明该病毒确实为AnHV。PCR 扩增产物测序结果见图6。

2.4 病毒滴度测定

将10-1～10-10梯度的病毒悬液接种EEK，置于27 ℃培养，逐日观察细胞变化并记录CPE，按照Reed-Muench 法计算得到病毒滴度TCID50=10-6.8/0.1 mL。

2.5 温度敏感性试验

病毒悬液经30、40、50、60 ℃处理30 min 后接种EEK，病毒滴度测定结果（TCID50）分别为10-6.1/0.1 mL、10-4.6/0.1 mL、10-3.6/0.1 mL、0，空白对照组为TCID50=10-6.8/0.1 mL，表明该病毒株对温度较敏感，60 ℃处理30 min 可使其灭活。

2.6 酸碱度敏感性试验

分别用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 将病毒悬液酸碱度调至pH3 和pH11，置于27 ℃处理30 min 后接种EEK，病毒滴度测定结果为，pH3处理组TCID50=10-3.4/0.1 mL，pH11 处理组TCID50=10-2.1/0.1 mL，空白对照组TCID50=10-6.8/0.1 mL，表明该病毒株对酸碱均较敏感，强酸和强碱均可使其滴度明显下降。

3 讨论

疱疹病毒是有囊膜的双链DNA 病毒，在哺乳类、两栖类和鱼类中广泛存在[23]。“脱黏败血症”在鳗鲡养殖中广泛发生，流行水温为24～32 ℃，主要发生于黑仔和幼鳗期，传染性强，并可导致鳗鲡在养殖过程中出现大量死亡。研究[8，21，24]表明，该病主要由AnHV 感染引起，感染鳗鲡后可导致鳗鲡出现黏液分泌增多，活力下降，肝脏发白，肾脏、胆囊肿大等多种症状。所以，要有效防控鳗鲡“脱黏败血症”的发生，首先需要将AnHV 从病料中分离出来，并对其进行生物学性质研究，然后利用其理化特性探索建立该病的防控方法。

鱼类细胞系的建立为分离、培养和鉴定鱼类病毒提供了重要的载体。不同的细胞系对不同病毒的敏感性有很大差异[7，25-26]。鱼类疱疹病毒有很强的宿主专一性[10，27]，分离培养时最好选用同一鱼类品种来源的细胞系[7，28]。利用常见鱼类细胞系如鲤上皮细胞（EPC）、草鱼卵巢细胞（CO）、胖头鱥肌肉细胞（FHM）等分离AnHV 尚未见有成功的报道。本实验室前期建立了鳗鲡肾脏细胞系EEK，并初步开展了EEK 对AnHV 的敏感性试验，确定该细胞对AnHV 敏感[7]，可用于AnHV 的分离。

本试验从鳗鲡养殖过程中经常出现的“脱黏败血症”病料组织，首次应用EEK 成功分离鉴定到一株AnHV。该病毒可引起鳗鲡肾脏细胞收缩变圆，逐渐脱壁悬浮死亡。病毒测序结果显示，其与已公布的AnHV 序列具有高度的同源性。该AnHV毒株的温度和酸碱度敏感性试验显示，30 ℃处理30 min 后AnHV 滴度下降不显著，40 ℃、50 ℃处理30 min 后滴度明显下降，60 ℃处理30 min 可完全灭活；AnHV 对酸碱都比较敏感，在pH3 和pH11处理后滴度均明显下降。这与葛均青等[21]的研究结果较一致。

病毒作为一种非细胞生命形态，由蛋白质外壳和内部的遗传物质组成，其致病性与温度、pH等理化因子密切相关。大多数病毒耐冷不耐热，且对酸碱较敏感，热、强酸和强碱等可使病毒蛋白发生变性，从而阻止病毒吸附于宿主细胞，也能破坏病毒复制所需的酶类，使病毒不能脱壳。所以在鳗鲡养殖过程中，可根据AnHV 对温度和酸碱的敏感性，通过调节养殖水体温度，使用酸性或碱性消毒剂对养殖工具和养殖环境进行定期消毒以预防和控制鳗鲡疱疹病毒病的发生。

4 结论

本研究应用EEK 成功从“脱黏败血病”鳗鲡内脏组织中分离到一株AnHV，进一步证实了同源的细胞系分离同一鱼类病毒的有效性。该AnHV毒株对温度和酸碱度均比较敏感，因而可利用该理化性质防控鳗鲡疱疹病毒病的发生。