基于CRISPR/Cas 系统的现场核酸检测技术

蒋 静，赵文亮，李文越，陶大刚，潘文雅，徐兵荣，肖 箫，谢胜松，蒋 羽

（1.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2.上海海关机电产品检测技术中心，上海 201308；3.上海海关国际旅行卫生保健中心，上海 201206；4.华中农业大学，湖北武汉 430070；5.洋山海关，上海 201308）

针对病毒性疾病频繁发生和肆意流行，早期诊断与预防非常重要[1]。随着现代分子生物学不断发展，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术在病原体鉴定与检疫检测中发挥了关键作用[2]。然而，该技术需要体积大且价格较为昂贵的实验仪器，以及专用实验场地和专业实验人员，限制了其现场核酸检测的应用。现场快速检验（point-of-care testing，POCT）技术以其快速、便利和成本低的优势脱颖而出，它不依赖专业实验室场地，无需借助昂贵的实验仪器，就能快速得出结果。它主要结合核酸等温扩增技术，如重组酶聚合酶扩增技术（RPA）或环介导等温扩增（LAMP）技术，而这些技术已在病原微生物核酸检测中得到应用[3]。

近年来发明的CRISPR/Cas 技术具有强大的基因编辑能力，其中Cas12a、Cas13a 和Cas14a 等蛋白被发现可以用于核酸检测[4-6]。由这些Cas 蛋白与crRNA 形成的复合物在特异识别靶标基因后，可以激活单链DNA 切割活性，在反应体系中引入荧光-淬灭基团修饰的单链报告DNA 分子，其被Cas 酶切割后可以通过仪器检测到荧光信号。基于这种原理，目前CRISPR/Cas 生物传感系统大致可分为SHERLOCK 技术，其可以检测RNA 靶标[7]，以及HOLMES 和DETECTR 技术，其可以检测DNA 靶标[8-9]，并结合核酸等温扩增技术，可以满足高灵敏性、高特异的POCT 应用场景，因此CRISPR/Cas 生物传感系统也被评为下一代生物传感诊断平台[5]。

1 CRISPR/Cas 生物传感系统原理和应用

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物中存在的一段重复序列，最初是细菌抵抗外来病原体入侵的自我防护方式。直到2012 年，通过体外试验发现，成熟的crRNA 通过碱基互补配对与tracrRNA 形成特殊的双链RNA 结构，可以指导Cas9 蛋白靶定目标DNA 引起双链断裂[10]。由此开发了基于CRISPR/Cas 系统的基因编辑技术。

根据CRISPR/Cas 系统中效应蛋白的不同，可以将该系统分为两大类：I 类CRISPR-Cas 系统，利用多蛋白效应复合物和向导RNA 结合实现基因编辑，主要包括I、III 和 IV 型；II 类CRISPR/Cas系统，仅需要单一蛋白效应器和向导RNA 进行基因编辑，主要包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型[11-12]。随后发现了蛋白结构更为单一、分子量更小的Cas12a、Cas13a和Cas14[7，9，13]，其具有在结合目标基因后激活非特异性切割活性的特性，从而被广泛应用于核酸检测。这种生物传感核酸检测技术和传统核酸检测技术相比，具有更高的检测灵敏性和特异性（表1）。

1.1 靶向识别DNA 分子的CRISPR/Cas 生物传感系统

第II 类CRISPR/Cas 系统的Ⅴ型Cas12a（又称Cpf1）是RNA 引导的特异性识别切割DNA的核酸内切酶（图1-A）。有研究[14]指出，Cas12a、crRNA 和靶标DNA 形成三元复合物后，会产生非特异性切割荧光-淬灭单链DNA 报告基团而发出荧光信号。Li 等[8]最先开发HOLMES 技术用于快速检测靶标DNA 和RNA，其先以PCR扩增目标基因，实现了对伪狂犬病毒（PRV）和日本乙型脑炎病毒（JEV）的核酸检测以及PRV/JEV毒株的分型、人基因单核苷酸的多态性（SNP）分型，其检测灵敏性可以达到单分子水平。此外，基于Cas12a 的DETECTR 核酸检测技术与HOLMES技术不同，其结合RPA 技术对目标基因进行扩增，可检测人乳头瘤病毒（HPV），并能区分HPV16和HPV18 毒株[9]。为了能直接检测RNA 靶标基因，Li 等[15]利用LAMP 技术对目标基因进行扩增，结合Cas12b 酶切建立了HOLMESv2 核酸检测技术，实现了单个碱基特异性区分，其不仅可直接检测RNA，还能定量检测DNA 甲基化水平。同样利用Cas12b 蛋白，Teng 等[16]建立了CDetection 检测技术，实现了单分子级的高灵敏与单碱基特异检测。研究[13]指出，同属第II 类CRISPR/Cas 系统的Ⅴ型Cas14a，在激活后也具有非特异性核酸分子切割活性（图1-A），但与Cas12a 不同，它对目标基因的识别不依赖前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。研究还发现，基于Cas14a 系统的DETECTR-Cas14a 技术检测单碱基特异性更强，然而其仅能识别单链DNA 分子，因而在对目标基因扩增完成后，需要解开DNA 双链才能实现核酸检测。

1.2 靶向RNA 分子的CRISPR/Cas 生物传感系统

第II 类CRISPR/Cas 系统的Ⅵ型Cas13a（又称C2c2），是RNA 引导的特异性识别切割RNA的核酸内切酶（图1-B）。Cas13a 能在crRNA 的引导下特异性切割单链靶标RNA，产生非特异性切割单链RNA 的活性。与Cas12a 类似，在试验体系中引入荧光-淬灭报告基团同样可用于核酸检测。基于Cas13a 系统，Gootenberg 等[7]开发出了SHERLOCK 技术来快速检测靶标DNA 和RNA。SHERLOCK 先通过RPA 或RT-RPA 对目标基因扩增，随后对扩增产物进行体外转录以作为靶标RNA 分子；检测核酸灵敏度为单分子水平，能够检测出寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV）的特定毒株，可对人的基因进行SNP 分型，以及检测肿瘤DNA 突变。在SHERLOCK 基础上，Gootenberg[17]等结合Cas12a、Cas13 以 及III 型CRISPR 效应核酸酶Csm6 开发了SHERLOCKv2检测技术，可实现高灵敏、多通道的多重核酸检测。进一步，结合HUDSON（一种核酸粗提法）、SHERLOCKv2 和侧向流试纸条检测技术，实现了高灵敏、不依赖精密仪器，对ZIKV 和DENV 进行核酸检测[18]。

2 CRISPR/Cas 生物传感系统应用于POCT

POCT 不需要复杂的实验仪器和专门的实验室场地，能在较短时间得到检测结果[19]。随着核酸检测普及化以及对现场化诊断的需求日益增长，POCT 技术发展迅速，不仅在疾病公共卫生领域中发挥重要作用，同时相关应用也正在向政府的进出口贸易保护方向扩展。目前将CRISPR/Cas 生物传感系统用于现场核酸检测，主要涉及核酸快速提取、目标基因扩增、Cas酶切和crRNA保存等方面（图2）。

2.1 核酸快速提取

病原体检测第一步是样品采集，然后是制备核酸，如DNA 或RNA。以往核酸提取主要在实验室通过机械裂解、酶裂解和化学裂解的方式提取，这种方法需要高速离心机等仪器设备，无法满足现场核酸检测要求。Myhrvold 等[18]提出了一种加热（未提取）临床样本以消除核酸酶来提取核酸的新技术（HUDSON），其对样本进行简单的热处理来裂解病毒，使病毒核酸释放出来，结合SHERLOCK 技术可实现直接对尿液或唾液中ZIKV 和DENV 的高灵敏检测。随着新冠病毒肺炎的全球性暴发，Joung 等[20]也提出了一种能在5 min内完成RNA 提取的方法，其能从鼻咽拭子样本中提取新冠病毒（SARS-CoV-2）RNA。针对非洲猪瘟病毒（ASFV）检测，Wang 等[21]通过室温孵育3 min，可实现裂解样品释放血清样本中的病毒DNA。这些核酸粗提方法非常有助于配合CRISPR/Cas 生物传感系统，用于现场核酸快速检测。

2.2 核酸等温扩增

核酸的高灵敏检测仅依赖Cas 蛋白难以实现，还需结合核酸扩增方法，如PCR 技术[22]。该技术利用PCR 仪，通过变性、退火、延伸等步骤实现基因扩增。但其需要体积较大的仪器，因而难以用于现场核酸检测，需要借助RPA 或LAMP 等等温扩增技术[7，9，23]。LAMP 技术的特点是针对靶基因区域设计4 种或6 种特异引物，在链置换DNA 聚合酶的作用下进行恒温反应来实现核酸扩增[24]，如HOLMESv2 检测技术[15]。与RPA 技术相比，LAMP 技术更显优势，其中置换DNA 聚合酶（Bst3.0）可同时以DNA 或RNA 为模板直接进行扩增，更易于直接检测RNA[25]。基于此，利用DETECTR 技术检测SARS-CoV-2 仅需RT-LAMP一步法进行核酸扩增，进而采用Cas 酶切来检测荧光信号[26]。

2.3 Cas 蛋白与crRNA 冻干保存

由于蛋白变性或RNA 容易被外源核酸酶降解，通常他们需要保存在-20 ℃以避免失活，这可能阻碍了其用于现场核酸检测。因而，如何长期稳定保存Cas 蛋白和crRNA 是一个值得研究的问题。Kellner 等[27]利用真空冷冻干燥机，将Cas13a蛋白和crRNA 等反应试剂混合制作为冻干粉，以实现冷冻长期保存。Qian 等[28]将Cas12a 蛋白和crRNA 等反应试剂混合后，利用同样策略制作为冻干粉，发现其可在室温下保存1 个月左右。由此可见，将Cas 蛋白和crRNA 冻干的策略可解决长期保存的问题，但还有待深入研究。

2.4 检测结果判读方法

CRISPR/Cas 生物传感系统识别靶向目标基因后，具有非特异性切割报告基因的特性。为了实现现场核酸可视化检测，目前主要结合侧向流试纸条和荧光可视化检测技术。侧向流试纸条检测的原理是，在反应体系中使用末端带有荧光素和生物素标记的DNA 或RNA 报告基因（FAM-ssDNA/ssRNABiotin）[29]。在试纸条的一端带有能够与生物素结合的链霉亲和素，在另一端带有与报告基因荧光素结合的金纳米颗粒标记的抗荧光素抗体。当Cas 蛋白和crRNA 识别目标基因后，会切割报告基因，使荧光素释放出来，沿着试纸条向另一端移动，在试纸条上出现样本线来指示检测到的靶分子，就像“验孕棒”一样可直接根据试纸条上的条带，判断检测样本是否为阳性[28]。Gootenberg 等[7]及Joung等[20]利用SHERLOCK 技术建立了检测SARSCoV-2、ZIKV 和DENV 等多种病毒的检测方法。此外，Wang 等[21]在CRISPR/Cas12a-LFD 中实现了对ASFV 的高灵敏度检测，Broughton 等[26]利用DETECTR 技术实现了45 min 检测SARS-CoV-2。

此外，基于荧光信号也可实现现场核酸检测。He 等[30]通过研发便携式荧光信号采集仪器，结合Cas12a 技术可高通量检测ASFV。Wang 等[31]通过开发Cas12aVDe 技术，实现了只需蓝光就可检测支原体。特别是华中农业大学研究团队对多种荧光-淬灭报告基因进行筛选和比较，成功建立了增强荧光可视化核酸检测新技术，成功实现了荧光可视化检测ASFV[32]，后续还报道了无需借助荧光仪器，直接裸眼可视化检测溶液颜色变化的核酸检测方法[33]。Li 等[34]采用离子体金纳米（AuNPs）对报告基团进行改造，同样建立了直接裸眼观察反应溶液颜色变化即可检测葡萄藤红斑病毒的核酸检测技术。这些对结果判读方法的优化，极大促进了CRISPR/Cas 生物传感系统应用于现场核酸检测。

3 展望

基于CRISPR/Cas 系统的核酸检测技术被认为是下一代生物传感诊断平台，其应用于现场核酸检测主要为两大类：以DNA 作为靶向识别分子（HOLMES、DETECTR、Cas12aVDet）[8-9，31]和以RNA 作为靶向识别分子（HUDSON、SHERLOCK等）[7，27]。为了实现现场核酸检测，还需要解决一些关键的问题，如：为了提高Cas 蛋白对靶标基因识别的灵敏度和特异性，有必要开发和改造出新型Cas 蛋白[35-36]；野生型Cas12 蛋白需要识别PAM才能发挥活性，有必要开发不限PAM 的Cas12 蛋白，以扩大靶标检测范围[37]。尽管等温扩增能实现超高灵敏检测，但容易受气溶胶污染，导致假阳性判读[38]，因而可采用不开盖的一管法，降低假阳性。此外，侧向流试纸条或便携式荧光检测仅能实现定性核酸检测，在满足便携式检测需求的前提下如何实现定量核酸检测，也将是未来值得研究的方向[39]。

为了更大范围地推广应用此技术，应该进一步评估现场化的临床检测效果，同时还需要更多的研发投入，以降低检测成本，确保试剂能稳定长期保存。除了对病原微生物进行检测外，在政府的贸易保护方面，对于进出口动物源性产品成分鉴定的检测需求也被提上日程。CRISPR/Cas 技术已被证明是非常适合现场核酸检测的新技术，相信未来该技术将在核酸检测领域得到更广泛应用。